液相色谱的定性及定量技术.ppt

液相色谱的定性及定量技术 Waters LC School 培训教材 色谱峰定性 鉴别每个色谱峰 通过比较保留值(通常是保留时间)的方法，找到各色谱峰所对应的组份 大多数情况下用比较保留时间来定性 即所谓： 保留时间相同，可能是同样的组份 保留时间不同，肯定不是同样的组份 用保留时间定性 用“标样”的保留值定出被测组份的位置 进一步的确认 标准加入 同时用其他方法 其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱） 其他检测器 PDA，光谱图比较、谱库检索 MS，质谱图解析、谱库检索 其他仪器方法 标准加入法举例 废水样品中五氯苯（PCP）的分析 峰一致性的确认 确认色谱峰的纯度 保证每个色谱峰下只有一个被测的组份 检查是否有共流出的物质（杂质）干扰 色谱峰纯度确认的方法 用光电二极管矩阵检测器比较光谱图 峰纯度鉴定，双波长Ratio 996的纯度角理论 用二极管矩阵检测器比较光谱图 苯的色谱及光谱图（Index） 996的纯度角理论 996的纯度角理论可快速得到纯度结果 定量分析的具体内容 确定样品的类型，主要成分/痕量成分 使分析条件的分离度（R）大于：1.5 色谱峰的定性，峰一致性测定 检测限及定量限：确定灵敏度及线性范围 用标样建立标准曲线 检查方法的准确度及精确度 用标样定期检查方法 痕量分析 如信/噪比不够，定量的精确度会受影响，因此要： 分析前浓缩样品 选择高灵敏度检测器 用衍生法 使色谱体系最优化 使用短的微径柱（减少样品的稀释） 使用高效色谱柱 使k值尽可能小 增加进样体积和浓度 使用低流速（N增加） 采用梯度淋洗 液相色谱定量的精度 测量的精度 定量的准确度 误差∶ E = O - T O∶观测到的值 T∶真值 液相色谱定量精度的计算 测量精度的计算 准确度的衡量 色谱方法是相对定量方法，如不考虑损失及杂质干扰等的因素，其结果同“标样”的准确程度关系密切 一般的衡量方法是做回收率实验或不同方法之间的比较：相关系数 相关系数： 其中，X及Y分别代表不同方法的实验值及平均值 准确度的影响因素 标样的可靠性及其配制的准确度 色谱方法的可靠性 色谱泵的精确度（GPC的影响更大） 进样器的准确度，进样技术 流速与检测面积的关系 如在不改变系统效率的情况下，流速降低峰高几乎不变，然而峰面积与流速相应成反比增加。 溶剂强度、K及峰高的关系 柱效和峰高的关系 如其他因素不变，如：K‘，a，流速等，柱效增加峰面积基本不变，而峰高增加。 常用的定量方法 峰面积百分比法 由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用 外标法 在液相色谱中用的最多 内标法 准确，但是麻烦 在标准方法中用的最多 外标法定量 配制一系列已知浓度的标样 外标法定量（二） 实际色谱图 外标法定量（三） 计算公式 特点 无需各组份都被检出、洗脱 需要标样 标样及样品测定的条件要一致 进样体积要准确 进样技术对定量结果的影响 固定体积定量管（loop）的进样器精度最好，其准确度取决于进样器的结构 可变体积进样器的精度取决于操作者的技术，准确度通常更高，因为进样用的注射器结构的准确度高，操作者的技术水平也有影响，但不大 WISP自动进样器精确度及准确度都可达到定量管进样器的水平，因为其每一微升分27步以上。然而它又保留了可变体积进样器的优点 内标法定量（一） 配制一系列浓度的标样，其中加有内标样 内标法定量（二） 实际色谱图 内标法定量（三） 计算公式： 特点： 无需各组份都被检出、洗脱 需要标样，需要内标样 结果与进样体积无关 内标法定量（四） 对内标物的要求 化学结构与待测组分相似(同系物、异构体) 在样品中不存在 不与样品中组份发生任何化学反应 保留值与待测组分接近 浓度（响应值）与待测组分相当 其色谱峰与其他色谱峰分离好 峰面积百分比法定量 公式： 特点： 各组分要全部流出、全部被检测，并对检测器的响应值一样简单，液相色谱目前很难做到这点 与进样量无关 不需标样 简单 可接收的检测范围 校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误 定量校正曲线 曲线A： 因在零浓度时仍有色谱峰，可能有杂质未分开 曲线B： 在此浓度内，检测器的响应值是非线性的 曲线C： 可接受的理想状态，实际情况应是∶其延长线到零点 曲线D： 表明有样品的损失，可能是色谱柱的非特征吸附，也 可能是样品制备时的损失 梯度曲线 梯度曲线 PCP 4 ppm 3 ppm 2 ppm 1 ppm 标准曲线 标准曲线