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中山大学硕士论文 RNAi技术构建NFl肿瘤细胞模型的实验研究 RNAi技术构建NFl肿瘤细胞模型的实验研究 专 业：神经病学 硕士研究生：李伟峰 导 师：周列民教授 中山大学附属第一医院广州(510080) 中文摘要 i．研究背景 I型神经纤维瘤病(neurofibromatosis 1，NFl)是源于神经嵴细胞 type 分化异常而导致的多系统损害的常染色体显性遗传病。 多发性皮肤和皮下神经纤维瘤是NFl的主要临床特征之一，它主要是由雪旺 细胞和成纤维细胞组成的良性异质性肿瘤，近来的研究倾向于认为雪旺细胞为其 起源细胞，我们课题组前期的实验也证实了这一点。 NFl基因是一个大的基因，编码的蛋白质称为神经纤维紊，该蛋白含有与酵 白主要作用是通过促使Ras从活性的GTP形式转化为非活性的GDP形式来抑$1]Ras 的活性。根据国内外对NFl的研究，目前认为NFl患者神经纤维瘤的发病机制主要 与NFl基因突变导致雪旺细胞rasGTP水平增高有关，但其确切的机制仍不是很清 楚。 RNAi技术是通过双链RNA介导的特异性降解靶mRNA导致转录后基因表达水平 下降的一种方法，是近年发展起来的特异性抑制基因表达的重要手段，被广泛用 于基因功能的研究。最近，发卡样siRNA表达载体的应用为RNA干扰技术的推广应 用开辟了广阔的前景，其方法是通过台成靶基因的特异性发卡样短链寡核苷酸序 列，定向亚克隆入真核表达载体，再转染细胞后，通过胞内自身的RNA聚合酶Ⅱ1的 作用，自动释放出双链siRNA干预特异性靶基因mRNA的翻译。该方法简便易行，构 建的载体也易保存和大量扩增，因此倍受关注。现已证明：siRNA干扰技术是目前 研究基因功能最有效的方法，在体内外实验中得到广泛证实。 2．研究目的 本研究旨在采用RNAi技术，通过构建NFl基因特异性siRNA质粒表达载体， 特异性的抑N4,鼠离体雪旺细胞中NFl基因的表达，并观察其介导的雪旺细胞生 中山大学碗一L论文 I《NAi技术构建NFl肿瘤细胞模型的实验研究 物学行为的改变，从而建立NFl体外肿瘤细胞模型，为研究NFl基因的功能和进 一步探讨NFl的发病机制提供新的思路。 3．研究方法 3．1重组pGenesi卜1．0一U6一siRNA—NFl质粒的构建和鉴定 number 根据GeneBank(accessNM_010897)小鼠NFlmRNA的已知序列，我们 寻找符合特征的3个siRNA靶序列，随后合成了相应的6条寡核苷酸，再将两两 2i}b的寡核苷酸经退火后所形成的序列克隆到pGenesil—1．O—u6载体上，构建 0感受态细胞，进行 表达siRNA的3种质粒。然后将3种质粒转化大肠杆菌DH5 卡那霉素抗性筛选，取阳性菌落扩大培养，快速制备少量质粒，通过酶切反应鉴 定重组质粒。 3．2特异性siRNA载体对NIH3T3细胞株中NFl基因表达的抑制以及质粒筛选 为便于进行质粒筛选，首先在NIH3T3细胞株中对NFl基因表达的抑制效果 进行了初步探索。将N1113’r3细胞株分为六组：空载体组，脂质体转染组及阴性 si sJ 对照组，NFlRNAI组，NFl 水平观察这3种sjRNA质粒产生的RNA干扰效应并进行半定量分析，筛选出沉默 效率和特异性最高的SiRNA质粒。 3．3利用RNA技术建立NFl肿瘤细胞模型的实验研究 首先取m生后4—7天的野生型C5781。／65L鼠的双侧坐骨神经以及双侧臂丛神 经进行雪旺细胞的分离纯化培养，并通过MTT法进行细胞活力鉴定。然后在传至 第二代的离体雪旺细胞中观察已筛选出的siRNA质粒l对NFl基因表达的抑制效 应。将离体雪旺细胞分为四组：空载体组，脂质体转染组及阴性对照组，siRNA 分别从蛋白}UmRNA水平检钡,,UNFl基因的表达水平的改变