一氧化氮对豚鼠蜗外毛细胞l-型钙通道电流影响的实验研究.pdf

一氧化氮对豚鼠耳蜗外毛细胞L一型钙通道电流 影响的实验研究 摘 要 目的：研究一氧化氮(nitricoxide，NO)对豚鼠耳蜗外毛细胞 L-型钙通道电流(Ic,．L)的影响，探讨一氧化氮(NO)对外毛细胞 L_型钙通道电流(Ica．L)的作用机制，以及如何调节外毛细胞的功能 状态，从丽影响某些内耳疾病的发生和发展，为临床防治梅尼埃病、 突发性耳聋、老年性聋、噪声性聋等内耳疾病提供理论依据和新的思 路。方法：采用急性酶分离方法分离细胞和全细胞膜片钳记录通道电 流。1．细胞分离选择耳廓反射灵敏的健康花斑豚鼠(250～4009) 显微镜下去除耳蜗骨壳，保持膜迷路完整，断轴后取出膜迷路，迅速 放入含胶原酶Ⅳ的D’Hanks液中消化10～20分钟，再置入含钙的 Hanks液中浸浴5分钟，以便终止消化。再放入预先用多聚赖氨酸处 理过的浴槽中，显微镜下撕去螺旋韧带，机械分离出外毛细胞，静置 10分钟贴壁后，可用于实验。2．通道电流记录取急性酶机械分离的 钳全细胞记录方式记录其L．型钙通道电流，所得电流通过膜片钳放 川P．Clamp9．0分析软什进行分析处理，，i：选川以下分析指标：(1) density)。 特性通过改变指令fU』K(VT)，观察并记录该通道电流的电生理特 性，包括通道开放的IU压依赖性，电流幅值，电流密度，电流．电压 曲线。并观察通道电流是否具有“Rundown”现象。观察L．型钙通道 特异性阻断剂维拉帕米对通道活动的影响。4．药物作用观察(1)记 录到稳定的电流后，向浴槽内加入新配制好的L．Arg(L-精氨酸)溶 (NG．甲基．L-精氨酸)，观察其对L-Arg的拮抗作用。再选用另外的 细胞，同样在记录到稳定的电流后，依次向浴槽内加入1．0x104mol／L 外液灌洗，观察通道的恢复情况。结果：1．应用膜片钳全细胞记录方 法(whole—cell patchclamp technique)，记录到一电压依赖性的内向电 有明显的“Rundown’现象。2．记录到稳定的电流后，向浴槽内加入 为浓度依赖性抑制，用药后5分钟内各纰Ic。．L峰值电流密度增幅最大 pA／pF，增幅为一2．12％(n=5)：1．0x10击mol／LL-Arg组从3．78+1．40 fl【从3．78±I，40 L—Arg pA／pF 部分恢复。L。Arg浓度超过2．0×10。6mol／L通道电流则表现为激活，用 加用2．0x10～moi／L L．NMMA后通道fU流被抑制，逐渐恢复到对照水 录到稳定的电流后，单独向浴槽内加入不同浓度L．NMMA，通道电 流无明显变化。结论：1．本实验测得的电流为钙电流，具有电压依赖 性、“Rundown”现象、对L_型钙通道的特异性阻断剂敏感等特性。 2_f氐浓度的NO供体L—Arg可以抑制单离外毛细胞L-型钙通道电流， 高浓度的NO供体L．Arg则可以激活豚鼠耳蜗外毛细胞L．型钙通道|U L-Arg对通道电流的激活作J1j。3．实验结果证明，在NO对耳蜗外毛 细胞L．型钙通道电流影响的过程巾，存在NO／Ic。．L途径。4．根据实 验结果推测，豚鼠耳蜗外毛细胞内存在抑制Ca2+升高的其它某利一 途径或负反馈调节机制。 关键词：一氧化氮；外毛细胞；钙通道；IF蜗；膜片钳技术 ofOuterHairCells ofNitricOxideonCalciumChannels Effects of inGuinea Cochlea Pigs and of theeffectsmechanics Abstract：0bjective：Tostudy