基因分析的基本策略资料.ppt

Northern blot印迹杂交是指待测RNA样品经电泳分离后转移到固定支持物上，然后与标记的核酸探针进行固-液相杂交。原理同Southern blot。 但因Northern blot印迹杂交法检测的是RNA，在外界环境中极易被环境中的RNA酶所降解，因此制备RNA样品时，所需器皿均需要特殊处理。同时作为监测细胞内RNA含量不够准确，只能作为定性分析RNA方法。 （一）Northern blot定性分析RNA的常用方法 RT-PCR是一种以mRNA为模板的体外扩增cDNA的技术。其基本程序是：提取细胞总RNA，然后将其中的mRNA在体外逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，进行特定基因的PCR扩增。因为PCR扩增产物有平台效应，故RT-PCR也一般用于RNA的定性分析。 但如果将阳性参照基因作为内参照与待测RNA在一个反应体系中进行扩增，可以对RNA进行相对定量分析。参照基因： β -肌动蛋白（β-actin）、3-磷酸甘油醛脱氢酶、rRNA基因等。 （二）RT-PCR用于定性、定量分析RNA方法 三、RNA酶保护试验—了解基因转录后的选择性剪接 RNA酶保护试验是利用Rnase A和Rnase T1能专一的降解单链RNA而双链RNA受到保护的特性，用体外转录合成的放射性核素标记的RNA探针与待检测mRNA进行液相杂交，使RNA探针和待测RNA间在互补序列处形成杂交体，然后用Rnase A和Rnase T1切割此RNA杂交体，受到保护的RNA通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，从而估计待检测mRNA情况。 RNA酶保护试验：可用于①mRNA定量、 ② mRNA末端定位、 ③ mRNA剪切部位④确定内含子在相应基因中的位置。 RNA酶保护试验：全新的mRNA定量分析方法 其基本原理是将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA；未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化，故该方法命名为RNA酶保护实验。 监测大量基因表达的最好方法之一是cDNA微阵列技术，利用这种技术可以同时测定成千上万个基因的转录活性。 cDNA微阵列技术的基本原理与核酸分子杂交方法是一样的。都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性或定量分析基因的表达情况。利用cDNA微阵列能在同一时间内平行分析大量的基因转录产物，进行大量的信息筛选和检测分析。 三、 cDNA微阵列（ cDNA芯片）可同时分析大量 基因的转录活性 目前研究蛋白质的技术一般多采用免疫印记技术（Western blot）或免疫组化染色对蛋白质进行分析。目前在1、研究转基因的活性。2、研究克隆基因的表达。上必须选用蛋白质技术对基因的表达活性进行分析。 第三节 利用蛋白质的定性定量定位 分析揭示基因的表达活性 Western blot是一种免疫印记技术，其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。 基本过程：蛋白质样品制备和SDS分离； 蛋白质的转膜； 标记的抗体与膜上蛋白质的抗原抗体杂交； 检测并分析标记物信号。 （一） Western blot可对细胞总蛋白中的 特定基因产物进行鉴定 流式细胞术也称为荧光激活细胞分拣技术。是一种快速定量分析细胞的新技术。其基本原理也是抗原抗体的特异结合，但抗原一般位于活细胞表面或内部的蛋白质分子，用荧光标记的抗体与抗原结合，经过流式细胞仪分析荧光信号，从而根据其信号的强弱，来判断细胞内某基因的表达活性。 对转染细胞的外源基因表达情况也可以采用此法。 二、流式细胞术可在细胞水平上分析特定蛋白质 免疫组化其基本原理是利用显色剂标记的特异抗体在组织或细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学显色反应检测特定抗原。 免疫组化将免疫反应的特异性、组织化学的可见性和显微镜的显像和放大作用巧妙地结合起来，成为蛋白质水平分析基因的直观特异的方法之一。 （三）免疫组化方法可对细胞内或组织中的特定基因 表达产物进行定性和半定量分