RTPCR(包括引物设计)概述.pptVIP

实验步骤 流程示意图 反应体系 dNTP?Mixture (dATP、dCTP、dGTP和dTTP) DEPC H2O 上机操作 运行程序 结果分析 结果分析 TaqMan法举例 材料准备 从正常肺组织中提取的总 RNA 从肺癌组织中提取的 总RNA -Trizol -裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS） -液氮 -RNA保存液 小心DNA污染！ -使用DEPC处理相关器材 最常用 下游应用：是否检测其它基因？ 检测何种剪接体？ 是否会有二级结构干扰？ 检测灵敏度是否足够？ 逆转录 逆转录引物选择 常用 一步法 or 两步法？ 两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检 测多个基因。便于反应优化。 推荐：工作的初期阶段 RealSYBR 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX RealSYBR 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX RealSuper 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX 一步法：简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。 推荐：工作的成熟阶段 （实际上：不推荐） RealSuper 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX PCR体系Master mix的选择 DNA聚合酶 Primers Dye Buffer and dNTPs Template Real-time PCR cDNA 关键 Real-time PCR 总原则与普通PCR相同 –避免引物二聚体，避免二级结构 尽量小些 （70 - 300bp) 目标区段位置：考虑目标剪接体 推荐做跨intron设计 EXON 1 EXON 2 INTRON 2 DNA EXON 1 EXON 2 RNA 引物设计 PRIMER PREMIER 5.0 点击 * 实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 中山大学中山医学院 内 容 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量技术的应用 PCR： 国王和象棋的故事 N = 264 -1 = 18446744070309551615 PCR：伟大的天才发明 PCR原理简介 PCR：理想与现实 反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能 终点检测，与看家基因对照，所谓 ‘半定量’：不可接受。 实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量PCR原理定量原理 介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析 通过看家基因和目的基因的Ct值进行相对定量 实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件 实时荧光定量PCR 原理 -------荧光阈值 荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值 实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 C(t) value 实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性 横轴：PCR反映循环数 纵轴：荧光信号量 Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 实时荧光定量PCR 原理 --