PCR技术原理及人的SRY基因扩增概述.pptVIP

PCR技术原理及人SRY基因扩增 DNA的结构 DNA的复制 模板：基因组DNA 原料：游离的核苷酸 A、G、C、T 催化剂：DNA聚合酶 需要的条件： 活细胞内的微观环境 DNA的复制 体内in vivo 体外in vitro DNA的复制 PCR技术的发明 Kary B. Mullis Californian highway Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 ?1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 ?1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。 ?1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 PCR技术的特点 1 ）高度的灵敏性 2 ）特异性 3 ）操作简便易行 4 ）用途广泛 30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝） 生命科学：DNA重组、转基因生物 医学工程：基因疫苗、产前诊断 疾病诊断：艾滋病、禽流感 法医学：血迹、精斑等痕迹DNA 考古学：远古人类、猛犸DNA PCR技术的应用 人的性别决定 人的性别决定 Father Mother 22pairs+XY 22pairs+XX 22+X 22+Y 22+X sperm egg 22pairs+XX 22pairs+XY Girl Boy 1959年生物学家发现Y染色体决定人（和老鼠）的男性特征; 1975年，Wachtel等提出Y染色体上有一个组织相容性抗原的基因H-Y和男性决定有关; 1987年, David Page认为Y染色体上一个特定的基因ZFY是决定男性的基因; 1988年,澳大利亚的Sinclair实验室发现袋鼠类的ZFY基因不在Y染色体上，而是在常染色体上; 1990年，澳大利亚女科学家Marshall Graves 和英国的Lovell-Badge两个实验室发现另外一个基因SRY。 人的性别决定 ———————— Y SRY 男性 利用PCR技术检测SRY基因 男性，有SRY——阳性结果 女性，无SRY——阴性结果 应用：奥运会运动员的性别鉴定 犯罪现场血痕、毛发的性别鉴定 野生动物的性别鉴定······ 男 女 总体积 25 ?l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 反应体系 移液器（pipette） 枪头（tips） 反应管（tube） 95℃ 3min； 94℃ 30s、 52℃ 30s、 72℃ 30s 30个循环； 72℃ 延伸5min. 核酸电泳 1. 根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液。 2. 放入到微波炉内加热熔化 3.冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固。凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内 4.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去。 5.在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loading buffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内 。 6.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)；根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。 7.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置。