Q第十章聚合酶链式反应技术概述.pptVIP

PCR反应条件 PCR反应条件优化 反应温度（变性、退火、延伸） 反应时间（变性、退火、延伸） 循环次数（PCR效率及产物量） 1、温度 变性温度：94-97 ℃ 退火温度：低于引物Tm 5 ℃左右，一般55-60℃ 温度过高：降低扩增效率； 温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：72 ℃，此时Taq酶具有较高的酶促活性 2、时间 第一次变性应给予足够时间（5-7分钟） 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为 复性时间：30～60sec 延伸时间：1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min 3-4Kb的DNA片段，延伸时间3-4min 10Kb的DNA片段，延伸时间15min 3、循环次数 重复次数一般设为25～35个循环 扩增反应的平台效应： 理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长 PCR 产物分析Analysis of PCR products PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)限制性 片段长度多态性 1. 分析已知突变 。 2. 突变碱基涉及酶切位点的变化。 PCR 酶切 电泳 单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)的原理及特点 单链DNA片段 复杂的空间折叠构象(主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的) 一个碱基发生改变 影响 其空间构象, 在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 分离构象上有差异的分子. THANK YOU FOR YOUR ATTENTION ABI 7500实时荧光定量PCR仪 普通梯度PCR仪 PCR用途 生命学科：基因克隆、基因检测 医学：分子诊断-遗传病的诊断、病原体检测，基因配型 法医学：个体识别、亲缘鉴定 考古学 Nothing would be more specific and reliable than DNA for individual identification. Individual Identification Mum child fa1 fa2 * （4）模板DNA 但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。 ② 模板的量： 不能太多，100?l反应体系中100ng足够。 ① 纯度： PCR对模板DNA的纯度要求不高。 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，dNTP浓度200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 （5） Mg2+ PCR反应曲线 Gel analysis (琼脂糖凝胶电泳/聚丙烯酰胺凝胶电泳 ) : PCR 产物电泳，EB（溴乙锭）染色， 紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。 Restriction-endonuclease digestion analysis： 酶切、电泳分离。 产物的鉴定，基因分型，研究变异性。 Hybridization ： (Southern blot/dot blot ) electrophoresis/hybridization Sequence analysis：是检测PCR产物特异性的 最可靠方法。 常用PCR技术 原位PCR (in situ PCR) 多重PCR（multiplex PCR） 长距离PCR (Long-range PCR) 逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR） 荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR） 巢式PCR（nesting PCR）-4条引物 原位ＰＣＲ （In situ PCR） 原位聚合酶链式反应（In situ PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞