PCR技术在微生物的进展概述.pptVIP

PCR技术应用于微生物进展 专业： 姓名： 学号： 福建师范大学 聚合酶链式反应（PCR） PCR是什么：聚合酶链式反应。是一种体外酶促合成特定基因或DNA片段的分子生物学技术。通常由高温变性，低温退火（复性）及适温延生这3步反应组成的一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。 ①加样 ②扩增 ③电泳 ④观测 ⑤结果分析 PCR流程 PCR的优点 1 特异性强? ①碱基互补配对原则 ②Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性 ③靶基因的特异性与保守性 2 灵敏度高? 能将pg级的起始待测模板扩增到ug水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞。 3 简便、快速? PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪上进行扩增反应，一般在2～4小时完成。 4 对样本DNA的纯度要求低? 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品均可作为扩增模板。 微生物检测方面应用 （1）常规PCR技术 （2）多重PCR技术 （3）RT-PCR技术 （4）实时荧光定量PCR技术 （1）常规PCR技术 关于一次性使用卫生用品的微生物指标规定，我们可以了解到：不能有大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌存在于一次性使用卫生用品中。 通常要求定性检测这四种菌，规定采用的检测方法是微生物鉴定。 传统检测方法 先通过增菌或分离培养，然后进一步根据各菌群特征做一些鉴定试验，最后综合各项结果判断。 缺点：需要花费过多的时间，并且准确性不高。 PCR检测方法 例如绿脓杆菌的检测：相关研究表明绿脓杆菌外毒素A（ETA）基因仅在绿脓杆菌基因组中存在，可以作为模板来快速检测绿脓杆菌。 根据ETA基因序列设计特异性引物，通过PCR反应扩增目的基因序列，如果能够扩增出目的条带，就能据此来确定绿脓杆菌的存在。 （2）多重PCR技术 多重PCR：在传统PCR原理基础上进行改进，即在统一体系中加入多对特异性引物，对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增出多个目的DNA片段。 多重PCR很适宜于成组病原体的检测——肝炎病毒的感染，在同一病人或统一供血者体内，有时候存在多种肝炎病毒重叠感染，如：甲、乙、丙型肝炎病毒重叠。 （3）RT-PCR技术 RT-PCR：是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在微生物转录水平上检测基因时空表达的常用方法。 （4）实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析。 化学原理 化学方法分类 非特异性 SYBR Green I法 特异性 TaqMan探针法 SYBR Green I法 结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度。 TaqMan探针法 荧光基团，淬灭基团 FRET（荧光谐振能量传递） 识别特异性产物 通过实时荧光定量PCR技术不同种群成人的内肠道微生物菌群的菌群大小和普遍性进行长期检测。 对比利时人检测：双歧杆菌和普氏菌属的丰度分别为97%和70%，活菌数数量级高达1010。 对日本人检测：比利时人肠道菌群中的链状双歧杆菌的菌群大小和广度明显低于日本人（P0.001） 结论：这类种水平上的实时荧光定量PCR分析对于调查种族间的肠道微生物菌群的多样性有所帮助。 小结 PCR技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性。此外，与传统的微生物检测法相比PCR技术能缩短检测时间，从最初的普通PCR,到各种改良技术的运用,再到荧光实时定量PCR的出现,多种?多重PCR的综合应用已成为一种趋势，检测范围更加广阔。 将来会有越来越多的PCR衍生技术诞生，微生物检测的应用前景会越来越泛。?