PCR生化分析概述.pptVIP

分子生物学研究中最强大的实验技术之一 本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程 胞内DNA复制的基本体系 Mullis的第一个PCR实验 1983年9月中旬，Mullis在反 应体系中加入DNA聚合酶后 在37℃一直保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有看到 任何条带。于是他认识到有 必要用加热来解链，每次解 PCR原理 在80-100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。 当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。 PCR循环第一步：高温变性 30次循环后靶序列扩增的数量 胞内和胞外DNA复制环境的区别 细胞内复制和PCR的主要不同点 PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20-30个脱氧核苷酸。 PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。 PCR反应的条件 1. 温度与时间的设置 三温度点法：90~95℃变性，40~60 ℃退火，70~75 ℃延伸 二温度点法：适用于较短靶基因，94 ℃变性，65 ℃退火与延伸 2. 循环次数 循环次数决定了PCR的扩增程度，主要取 决于模板DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：非特异性产物的量增多 PCR反应的五个要素 引物 酶 dNTP 模板 Mg2+ Tm值 Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度下，50%寡核苷酸双链解链的温度。 Tm=4℃(G+C) + 2℃(A+T) 有效引物的Tm值为55~80 ℃，接近72 ℃为最佳复性条件。 （2）引物碱基构成 引物的GC含量一般40-60%，GC太少扩增效果不佳，GC过多易出现非特异条带。上下游引物的GC含量不能相差太大。 碱基随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶，尤其3’端不应超过3个连续的G或C，否则引物易在GC富集区域错误引发。 （4）引物3’端序列 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。 引物不能互补，尤其是在3’末端，否则会导致引物双链体的出现，此时的PCR产物是引物自身的扩增。 （6）引物的特异性 引物与非特异性扩增序列的同源性不要超过70%或有连续的8个互补碱基同源，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。 2. Taq DNA聚合酶及其浓度 特点： 耐高温，在70℃反应2小时后残留活性在90%以上，在93℃反应2小时后残留活性仍能保持60%，在95℃2小时后残留活性为原来的40%。 在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。 一般扩增的PCR产物长度可达2.0kb，且特异性也较高。 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降；酶量过少使合成产物量减少。 3. dNTP的质量与浓度 dNTP溶液的配置： dNTP粉呈颗粒状，溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris HCl的缓冲液将其pH调节到7.0~7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。 四种dNTP浓度应相等 浓度50~200μmol/L，取决于扩增片段的长度 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 4. 模板（靶基因）核酸 传统的DNA纯化方法用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 SDS：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀 蛋白酶K：能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白。 再用有机溶剂抽提除去蛋白质和其他细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，即可作为模板。 DNA模板的浓度一般1~10ng /?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 5. Mg2+浓度 Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-2.6mmol/L反应体系。 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异性扩增；浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降。 PCR的类型和应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他…… * * 第五章 PCR (Polymerase Chain Reaction) 聚合酶链式反应 People’s Choice Reaction 美国科学家 穆利斯（K.B.Mullis） 发明了PCR技术 1993年诺贝尔奖 PCR技术简史 DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ T