tDNA鉴定概述.pptVIP

* * 遗传学实验 模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 * 二、实验目的 提取植物基因组DNA的方法 PCR操作方法 琼脂糖凝胶分离核酸方法 * 三、实验原理 1. Ti质粒和T-DNA： Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段， 当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞， 并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。 * 将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中， 通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。 * 2. T-DNA插入基因内部导致基因突变 T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。 * 3. 用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。 在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。 * 利用三个引物做PCR鉴定纯合突变体 LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物 BP是T-DNA区段上的引物 * PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： * 扩增结果 经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子量较大的产物（大带）； 在杂和突变体，LP和RP能扩增出分子量较大的产物（大带）， 另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小带）； 在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小的产物（小带）。 * * 2*CTAB提取液(PH8.0) 2% CTAB 1.4M NaCl 20Mm EDTA(PH8.0) 100Mm Tris-HCl(PH8.0) 0.2%巯基乙醇 CTAB提取液（1000 ml）组成： 20 g CTAB 100 ml 1 M Tris-HCl pH 8.0 40 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 81.8 g NaCl 0.2%(V/V)β-巯基乙醇） * 步骤 1.用液氮将100 mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离心管中加入预热至65℃的600 μl 的2×CTAB提取液，轻摇混匀。 2.65℃水浴30 min，其间轻摇混匀。 3.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下轻轻混匀10 min，12000 rpm离心15 min，再转移上清入新管。 4.向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-20 ℃ 下30 min ，12000 rpm离心15 min，弃上清。 5.用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 6.将沉淀晾干，加20-50 μl TE (pH 8.0)， 65℃水浴30 min溶解DNA。 7. 琼脂糖凝胶电泳检测或用紫外分光光度计检测DNA的浓度和质量。 * PCR原理和方法　 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点； 能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断； * PCR标准反应体系 DNA模板 引物 反应缓冲液 dNTP ddH2O 耐热聚合酶 * 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板 纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物 浓度 加量过多导致非特异性扩增增加 特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体 完整性 避免反复冻融 浓度 应适当,过高导致非特异性增加,过低则 引 物 扩增产物太少 * 引物设计软件 PRIMER PREMIER 5 Oligo 6 * 反应体系对PCR扩增的影响 反应Buffer pH值,盐离子浓度 稳定剂,增强剂 Mg 2＋浓度 过高非特异性严重 过低无扩增产物 dNTP Mixture 浓度适当 避免反复冻融 ddH2O pH值适当 避免污染 * 如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ DNA 聚合酶的特性 纯 度 稳定性 酶活性 * 反应体系