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LUXTM Primers 报告人 查成刚 1. 简介 2. LUXTM引物设计 3. LUXTM引物的特点 4. 待解决的问题 5. 研究展望 1.简介 LUXTM( Light Upon eXtension)引物是继核酸染料（如SYBR GreenⅠ）、TaqMan双标记探针、Molecular?Beacon之后由美国invitrogen公司在2002年开发的一种新型实时荧光核酸扩增技术。 它为实时荧光定量PCR提供了一个高效、低成本的检测平台。 目前，实时荧光定量PCR根据其基本原理的不同可以分为2大类，一类是染料类（如SYBR GreenⅠ）；另一类是基于荧光共振能量传递（fluorescence resonance energy transfer , FRET) 原理，包括TaqMan探针，分子信标以及LUXTM引物等。 1.1 DNA结合染色原理 1.2 TaqMan 原理 1.3 分子信标原理 1.4 LUXTM原理 LUX ?引物包括荧光标记引物（用FAM或者JOE荧光标记 ）和相对应的未标记引物 ，单标LUX?引物设计荧光基团靠近3’末端，形成发夹结构 。该发夹二级结构能提供荧光淬灭功能。因此不需要单独的淬灭基团 。如图 2. LUXTM引物设计 LUXTM引物可以在网上在线设计：/lux 虽然有在线软件设计LUX引物,但还是应该遵循以下原则: 1、扩增的PCR产物的最佳长度是80-200bp。 2、靶序列必须至少要比扩增子长10bp。 3、序列的命名必须符合IUPAC（国际纯粹与应用化学联合会 ）的字母缩写标准。 4、设计参数时，系统预设的解链温度是60-68℃，此时引物的最佳退火温度是55-64 ℃。 3.LUX引物的特点 3.1 LUX? 的敏感性 通常可以检测100个或者更低拷贝数的目标基因，测量pg级数量DNA/RNA，达到7个数量级的动态范围 。 3.2 有效的多重反应能力 使用LUX?引物时，多重反应变得简单而有效。由于使用单标引物，每个靶标只需要监测一种荧光标记（如下图）。而使用双标探针技术，反应过程中每个扩增子需要检测两个波长――荧光子波长和淬灭子波长。类似SYBR? Green I的染料则不具备任何多重反应的能力。 3.3 与多种仪器兼容 使用LUX?引物，不会限制到任何专门的仪器平台，LUX?引物与种类广泛的实时PCR仪器兼容。如ABI PRISM? 7700/7000/7900/7300/7500、Bio-Rad iCycler? 、Stratagene Mx3000P?and Mx4000? 、Cepheid SmartCycler? 、Roche LightCycler?、MJ Research DNA Engine Opticon?。 3.4 费用低廉 使用LUX?荧光引物，全部费用大约只有TaqMan探针的一半 。 3.5 反应体系简便易行 反应体系 因为不需要探针，扩增体系简化，使反应动力学较简单因而反应条件更易优化，有利于提高检测方法的特异性 。 反应条件 4. 待解决的问题 因为没有探针控制特异性,因此LUX的特异性要弱于探针技术，而且检测结果单一，只能依靠荧光PCR仪来判断。对于引物二聚体等非特异性扩增还需要依靠熔解曲线来鉴别 。操作平台也需要依靠昂贵的荧光PCR仪器，不便于在基层推广。另外，目前invitrogen公司只推出了2种荧光基团（FAM JOE），因此也只是具备了二重反应能力。 5.研究展望 国外已将LUXTM 引物应用到HIV病毒载量的临床检测上。目前，国内已经有用LUX引物检测动物疾病的病原微生物，如牛传染性鼻气管炎病毒的二重LUXTM荧光PCR、鹅细小病毒LUXTM荧光定量PCR等。 可见，LUXTM引物的应用前景将极其广泛，并大大推动了荧光PCR技术的发展。 * * LUX? Effect : 18.5μl ddH2O 0.5μl 模板 0.5μl rTaq 0.5μl ssuis2J RU 0.5μl ssuis2J FU 2μl dNTP 2.5μl 10×PCR Buffer 15s 40cycles 20s 94 ℃ 54 ℃ 3min 94℃ *