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论体内稳定表达HER2多表位基因B16细胞系的建立 摘要：目的: 建立体内稳定表达HER2多表位基因的小鼠黑色素瘤B16细胞系。方法: 利用分子克隆技术构建真核表达载体pcDNA3GFPHER2, 阳离子脂质体介导法将其稳定转染入B16细胞, G418克隆筛选及体内传代后, 流式细胞术(FCM)分选出GFPHER2表达阳性细胞群, 对该群细胞进行无G418条件下的单克隆筛选并进行体内稳定性检测。结果: 经限制性内切酶鉴定及序列分析, pcDNA3GFPHER2构建正确; 最终建立的表达HER2基因B16细胞系体内传代后GFPHER2阳性率高于90%。结论: 成功建立了体内稳定表达HER2多表位基因的小鼠黑色素瘤细胞系, 为其他体内稳定表达外源基因的转染细胞的建立提供了借鉴。 关键词： 小鼠黑色素瘤细胞; HER2; 阳离子脂质体 　　基因转染技术是生物学研究的重要手段［1, 2］, 目前用于基因转染的载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。阳离子脂质体转染法属于非病毒载体介导的基因转染方法, 由于其具有操作方法简单、 可携带大片段DNA、 试剂商品化和毒性低、 安全和无免疫原性等优点, 而逐渐替代病毒载体并为广大研究者所接受。但阳离子转染法转染的细胞在体内存在稳定性差的缺点［3, 4］, 这也一直是困扰大家的的难题。为了解决阳离子脂质体介导的基因转染细胞的体内稳定性问题, 本研究以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）为报告基因, 将阳离子脂质体转染法及小鼠体内细胞传代、 流式细胞术(FCM)分选、 无G418条件下的体外筛选等技术相结合, 建立了小鼠体内稳定表达HER2多表位基因的小鼠黑色素瘤细胞系（B16）, 该实验体系的建立为其他体内稳定表达外源基因的转染细胞的制备提供了很有价值的参考。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 健康清洁级C57BL/6J小鼠(雌性, 6～8 周龄), 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。Lipofectin、 TRIzol试剂购自Invitrogen公司。pMD18THER2载体（含HER2多表位基因)、 pcDNA3GFP载体、 C57BL/6J小鼠来源的黑色素瘤细胞株B16由吉林大学白求恩医学院分子生物学实验室提供。G418、 IMDM干粉购自Gibco公司。标准胎牛血清（FBS）购自天冿TBD公司。限制性内切酶、 T4连接酶和DNA marker购自TaKaRa公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 pcDNA3GFPHER2载体的构建 应用Hind III和BamH I分别酶切pMD18THER2和pcDNA3GFP载体, 经琼脂糖凝胶回收, 将载体和目的片段进行连接, 连接产物转化E.coli JM109。挑选转化平板上的单菌落接种于5 mL LB培养基, 过夜培养, 以碱裂解法提取质粒。重组质粒经Hind III和BamH I双酶切鉴定并进行测序分析。鉴定正确的重组质粒用于细胞转染。 　　1.2.2 细胞转染及鉴定 参照说明书应用阳离子脂质体Lipofectin将pcDNA3GFPHER2转染入小鼠黑色素瘤细胞系, 转染后的细胞用含200 mL/L FBS IMDM（IMDM完全培养液）稀释, 按每孔0.2个细胞/100 μL铺96孔平底培养板, 37、 5 mL/L CO2孵箱中培养。次日, 每孔补加100 μL含1 600 mg/L G418的IMDM完全培养液, 1 周后用含800 mg/L G418的IMDM完全培养液换液。2 周后在共聚焦荧光显微镜下观察, 选择细胞状态好、 荧光强、 呈单集落生长的细胞进行扩增, 即获得GFPHER2表达阳性的B16细胞。将上述细胞经过液氮冻存、 37水浴复苏和连续传代培养2 周后, 用共聚焦荧光显微镜和FCM在蛋白水平上检测GFPHER2的表达。参照TRIzol试剂说明书提取转染细胞的总RNA, 逆转录后进行PCR反应, 检测HER2基因mRNA的表达（上游引物: 5′CTGCAGGATCCATGGACGAAGCATACGTTATGGC3′; 下游引物: 5′GCGGCCGCAAGCTTAAGATCTACCTTGCAGAGTCAGAGAGTAA3′）。 　　1.2.3 体内稳定表达HER2多表位基因B16细胞系的建立及鉴定 将3×105个细胞（G418 800 mg/L环境中培养）重悬于0.2 mL IMDM中, 皮下接种于C57BL/6J小鼠右侧后腿躯干处。待肿瘤大小约为1 cm×1 cm时, 进行无菌剖离, 研磨。将细胞悬液置于IMDM完全培养液中, 37、 50 mL/L CO