生化分离技术3课件.ppt

反胶束体系的分类 1. 单一表面活性剂反胶束体系 2. 混合表面活性剂反胶束体系 两种或两种以上的表面活性剂构成的体系具有更高的分离效率，非离子表面活性剂的加入可使反胶束变大，萃取相对分子量更大的蛋白质 3. 亲和反胶束体系 指体系中还含有与目标蛋白质有特异亲和的配基，可以使萃取的选择性大大提高 影响反胶束萃取的因素 蛋白质的反胶束萃取，与蛋白质的表面电荷和反胶束内表面电荷间的静电作用，以及反胶束的大小有关，所以，任何可以增强这种静电作用或导致形成较大的反胶束的因素，都有助于蛋白质的萃取。只要通过对这些因素进行系统的研究，确定最佳操作条件，就可得到合适的目标蛋白质萃取率，从而达到分离纯化的目的。 反胶束萃取的影响因素 反胶束的大小：反胶束一般为纳米级颗粒，直径介于10-200nm，阴离子表面活性剂形成的反胶束一般集聚数为50-100，阳离子型一般低于50，所以，一般阴离子型的比阳离子型的反胶束大，有机溶剂的类型，离子强度（强度增大，胶束变小），温度（温度上升，胶束增大）。添加助表面活性剂，也会改变胶束的大小。 反胶束萃取的影响因素 水相的pH值： 决定了蛋白质表面电荷的状态、从而对萃取过程造成影响。只有当反胶束内表面电荷，也就是表面活性剂极性基团所带的电荷与蛋白质表面电荷相反时，两者产生静电引力，蛋白质才可能进入反胶束。故对于阳离子表面活性剂、溶液的pH值需高于蛋白质的pI值，反胶束萃取才能进行；对于阴离子表面活性剂，当pH＞pI时，萃取率几乎为零，当pH＜pI时，萃取率急剧提高。 对不同相对分子质量的蛋白质，pH值对萃取率的影响有差异性，当蛋白质相对分子质量增加时，只有增大(pH-PI)值的绝对值，相转移才能顺利完成，如α-糜蛋白酶(相对分子质量为25000)的萃取率在pH值低于pI值2-4时达到最高，而牛血清蛋白(相对分子质量为68000)在相同的系统中不发生相转移。 这种差异性可解释为：对于大蛋白分子，其尺寸远大于“空核”的反胶束，萃取时势必要消耗较多的能量，这些能量只能通过较强的静电相互作用得到补偿。对那些尺寸小于“空核”的反胶束中水体积的蛋白质，只要其所携带的净电荷与表面活性剂电性相反，萃取就能发生。蛋白质的相对分子质量Mr与(pH-pI)绝对值呈线性关系 反胶束萃取的影响因素 离子强度：对萃取率的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用所决定的： 1.离子强度增大后，反胶束内表面的电层变薄，减弱了蛋白质与反胶束内表面之间的静电吸引，从而减少蛋白质的溶解度； 2.反胶束内表面的双电层变薄后，也减弱了表面活性剂极性基团之间的斥力，使反胶束变小，从而使蛋白质不能进入其中； 3. 离子强度增加时，增大了离子向反胶束内“水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向，使蛋白质从反胶束内被盐析出来； 反胶束萃取的影响因素 表面活性剂的影响: 应从反胶束萃取蛋白质的机理出发，选用有利于增强蛋白质表面电荷与反胶束内表面电荷间的静电作用和增加反胶束大小的表面活性剂，除此以外，还应考虑形成反胶束及使反胶束变大所需的能量的大小、反胶束内表面的电荷密度等因素，这些都会对萃取产生影响。 目前研究中常用的AOT反胶束体系和其他体系有许多不足，如不能用于分子量较大的蛋白质的萃取和往往在两相界面上形成不溶性的膜状物等等，为克服这些不足,可通过在单一表面活性剂中加入具有亲和作用的生物表面活性剂或另一种非离子型表面活性剂的方法来改善萃取性能。 表面活性剂浓度：增大表面活性剂的浓度可增加反胶束的数量，从而增大对蛋白质的溶解能力。但表面活性剂浓度过高时，有可能在溶液中形成比较复杂的聚集体，同时会增加反萃取过程的难度。 反胶束萃取的影响因素 有机溶剂的影响:有机溶剂的种类影响反胶束的大小，从而影响水增溶的能力，所以可以利用因溶剂作用引起的不同胶束结构实现选择性增溶生物分子的目的。 反胶束萃取的影响因素 助表面活性剂的影响: 助表面活性剂，能够增进胶束尺寸。助表面活性剂可以是一些非离子表面活性剂，或者短链的醇等，它们可以插入反胶团结构中，撑大反胶束尺寸。虽然助表面活性剂具有一定助溶能力，但是也使体系变得复杂，增加了反萃取的难度。 反胶束萃取的影响因素 温度的影响: 温度的变化对反胶束系统中的物理化学性质有激烈的影响，适度增加温度能够增加蛋白质在有机相的溶解度。 反胶束萃取的优势 优点： 1、成本低、溶剂可反复使用 2、萃取率和反萃取率都很高。 3、表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，因此可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。 4、保护蛋白质免受有机相的影响。 反胶束技术的应用 1. 蛋白质，氨基酸，抗生素等生物分子的分离 2. 用于蛋白质的复性：变性蛋白分子的分离，提供蛋白复性所需的微环境。