分子生物学基本研究法(下)精要.pptVIP

分子生物学-第5章 第6章  分子生物学研究法 （下） 本章主要内容 基因表达研究技术 基因敲除技术 蛋白质及RNA相互作用技术 基因芯片技术 其他分子生物学技术 SAGE的主要依据: 1、一个9～10碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的信息，能够唯一确认一种转录物。 2、如果能将9碱基的标签集中于一个克隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸顺序以连续的数据形式输入计算机中进行处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行分析。 SAGE是基因表达定性和定量研究的一种有效工具，非常适合于比较不同发育状态或疾病状态的生物基因表达。 SAGE能够接近完整地获得基因组表达信息，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。 1997年 Stephen 利用SAGE技术比较小鼠胚囊纤维细胞基因表达。 小鼠胚囊纤维细胞能产生对温度敏感的P53肿瘤抑制蛋白，通过SAGE比较两种不同温度下基因表达的差异。 结果：从约15000个分析的基因中，发现有14个基因的表达依赖于P53蛋白，3个基因的表达与P53蛋白的失活相关。 RNA alternative splicing 选择性拼接过程出错，会引发癌症、神经系统疾病! 果蝇Dscam基因可产生38016个剪切体 RNA原位杂交用放射性或非放射性标记的特异性探针与被固定的组织切片反应。 细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。 单色FISH 4、基因定点突变 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列。 常用于研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。 寡核苷酸介导的DNA突变技术（P198图6-6） 以PCR为基础：重叠延伸技术（P199图6-7） 大引物诱变法（P200图6-8） 以上三种方法虽不同，但原理都一致。 5’ ATGAATCATTCAAAAACACTTTTGTTAACCGCGGCAG3’ 5’ CGCCGTC3’ 5’ ATGAATCATT 3’ TACTTAGTAAGTTTTTGTGAAAACAATTGG CGCCGTC 5’ PCR介导的基因定点突变方法的优势 1、突变体回收率高。 2、能用双链DNA作为模板，可以在任何位 点引入突变。 3、可在同一试管中完成所有反应。 4、快速、简便。 6.2 基因敲除技术 基因敲除技术（gene knockout)又称基因打靶（gene targeting），通过基因工程方法将一个结构已知但功能未知的基因去除，或用其他序列相近的基因取代，然后从整体上观察实验动物，从而推测相应基因的功能。 人为地把实验动物某一种有功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。 基因敲除技术分类 完全基因敲除：用同源重组法完全消除细胞或者动植物个体中的靶基因活性。 条件型基因敲除：用定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。 同源重组：是指发生在非姐妹染色单体之间或 同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或 分子之内的重新组合。 真核生物基因敲除的技术路线主要包括： 构建重组基因载体； 用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导入胚胎干细胞纯系中； 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。 显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。 6.3 蛋白质及RNA相互作用技术 1、酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system） 蛋白质和蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础. 酵母双杂交(yeast two hybrid) 技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用，不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用，也可以发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 酵母双杂交