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可变剪接分析 yup@ 主要内容 可变剪接介绍 使用UCSC Genome browser分析 可变剪接成因分析 其它分析工具及数据库 基因表达谱 一、可变剪接介绍 可变剪接 (alternative splicing) 即一个 mRNA 前体通过不同的内含子去除方式可 以获得不同成熟mRNA 。 可变剪接示意图 可变剪接是生物多样性的重要成因 高等生物与低等生物的基因数量并没有特别显著 的差别，如人的基因估计约30000-40000，小鼠 的基因也为30000左右，而且人鼠基因有很多存 在有很高的相似性。果蝇、线虫等基因约为 15000，基因数量的差别不足以解释以上物种间 存在的显著差异。 可变剪接与蛋白质组 据估计，人40-60%的基因存在可变剪接形 式。通过可变剪接，产生多种蛋白产物， 放大了对不同物种基因组的差别，极大的 扩展了不同物种的变化空间。 可变剪接的生理意义 可变剪接与基因表达的时空性息息相关，在不同时期，不同组织基因的表达形式可能不同，与物种发育的不同时期对应。 可变剪接的调控与生物体的健康息息相关，其突变可以直接导致疾病。 1.1 可变剪接背景知识 内含子剪接信号 内含子剪接需要区分外显子及内含子，识别信号主要包括 内含子5‘ 及 3’ 末端序列及中间分支点（branch site）附近的序列。 内含子剪接信号 内含子5‘ 剪接点称为供体点（donor site），3’剪接点称为受体点(acceptor site)。 内含子开始和末尾的两对碱基最为保守，大多数情况为 GU-AG (约占99.24%),少数为GC-AG(约占0.7%), 极少数为AT-AC（0.05%)。除了这两对保守碱基外，他们附近的碱基在不同物种间存在差异，但在物种内有保守性。如如脊椎动物5’剪接信号AG|GUAAGU 。 内含子剪接信号 分支点（branch site）通常位于3‘剪接点上游50bp,处于一段富含嘧啶的区域，分支点腺嘌呤附近区域为YNYURAY 。 剪接识别信号 剪接体 剪接由剪接体（spliceosome）催化完成。剪接体主要由几个核糖蛋白亚基组成，每个亚基都由RNA链和蛋白组成。另外还有几十个小多肽参与构成剪接体。 剪接体分主要剪接体（major spliceosome） 和次要剪接体（minor spliceosome）。前者主要针对剪接信号为GU-AG模式的内含子，包括U1,U2,U4,U5,U6等亚基，后者主要对应AT-AC模式，由另外一组亚基组成 。 1.2 可变剪接的主要模式 可变剪接主要有四种模式： 内含子不切割 5’或3’切点竞争 外显子跳过 外显子互斥 可变剪接的主要模式 可变剪接的结果 由于采用不同的外显子，导致编码蛋白质的不同，有时会出现蛋白提前终止，起到分子开关的作用。 1.3 可变剪接的调控 可变剪接的调控机制目前还不清楚。但越来越多的研究表明，可变剪接的调控是通过基因序列上的顺式作用元件和核内反式作用分子的相互作用进行的。 可变剪接的调控 主要的顺式作用元件有： ESE: exon splicing enhancer 外显子剪接增强子 ISE: intron splicing enhancer 内含子剪接增强子 ESS: exon splicing silencer 外显子剪接沉默子 ISS: intron splicing silencer 内含子剪接沉默子 反式作用因子 SR 蛋白 因富含serine/arginine 得名，该蛋白通常含有一至两个RNA 识别模体（RRM，RNA Recognition Motif），羧基端有RS结构域（RS 二肽富集区）。 RRM负责介导RNA结合，决定各SR蛋白的底物特异性。RS结构域主要参与蛋白-蛋白相互作用。 SR 蛋白 SR蛋白主要与外显子剪接增强元件ESE结合，通过直接招募剪接体蛋白或是拮抗剪接抑制因子的作用来发挥作用。 SR蛋白主要对5’位点的选择起作用： 通过招募剪接体蛋白如U2AF或是U1-70K，在pre-mRNA的两个或多个5’可变剪接位点中促进选择使用距内含子3’端较近的5’位点。 其它反式作用蛋白 其它如hnRNP蛋白，多聚嘧啶序列结合蛋白(PTB)，CELF蛋白家族等等也有各自不同的调节作用。 ESE 与SR 蛋白的作用模式可能是可变剪接调控中最普遍的调控形式。已有实验表明由于外显子中剪接增强子序列的突变不能与SR蛋白结合可以导致外显子的跳过（exon skipping）。 二、可变剪接的分析 可变剪接的分析主要包括剪接体序列的校正，剪接体之间的比较，以及剪接机制的探索。 剪接体序列的校正 克隆试验得到的mRNA 往往不是全长，测序反应也不能保证100%的正确，所以拿到一条序列