胞内门冬酰胺酶实验讲义 (中文版)！.docVIP

实验一 重组表达门冬酰胺酶II工程菌的构建 【实验目的】 1. 了解构建重组质粒的原理 2. 掌握质粒提取方法、PCR技术、酶切等基本技术方法 【实验原理】 门冬酰胺酶，别名L-门冬酰胺酶、天冬酰胺酶或天门冬酰胺酶。L-天冬酰胺是细胞合成蛋白质的必需氨基酸。肿瘤细胞中的天冬酰胺合成酶含量非常低，故自身不能合成L-天冬酰胺，需依赖外源L-天冬酰胺才能生存。而L-天冬酰胺酶可通过降解L-天冬酰胺从而抑制肿瘤细胞中蛋白质的正常合成，导致肿瘤细胞的死亡。人体内正常细胞则因能自身合成L-天冬酰胺，所以受L-ASP的影响较小。故L-ASP可用于急性淋巴细胞白血病的治疗。目前临床上使用的L-ASP泛指来源于大肠杆菌的E.coli L-ASP II。从1974年天津生化制药厂开始生产L-ASP，到1995年吴梧桐教授等进行的E.coli天冬酰胺酶ansB基因的克隆和表达研究，并首次在国内成功构建了高效表达L-ASP的基因工程菌pKA/ CPU210009，工程菌发酵单位比野生株高出100倍。随后又优化了基因工程菌的培养条件和发酵工艺，确定了重组L-ASP 的纯化路线，并对重组产品进行了鉴定。L-ASP的制备纯化工艺越来越成熟，这些研究成果为我国工业化生产优质、低价的注射用E. coli L-ASP开辟了新的道路。 聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，利用DNA变性和复性的特点，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。 双酶切：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 　　纯化：纯化PCR产物分为割胶和柱式，柱式更好，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化可以去除引物，酶切掉的几个碱基也会被纯化掉，所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。 　　 【实验材料】 1. 试剂 pET22b菌液 pET28a-AnsB质粒 LB 液体培养基 氨苄青霉素(Amp) 琼脂糖 TAE缓冲液 染料 Loading Buffer 分子量Marker PCR试剂盒 酶切试剂盒 纯化试剂盒 2．器材 微量移液器 标准净化工作台 电子天平(精确到10mg) 恒温水浴锅 离心机 Eppendorf离心管架 灭菌的移液器枪头 灭菌的Eppendorf管（1.5ml微量离心管） PCR仪 电泳仪 凝胶成像系统 摇床 【实验方法】 1 PCR 1.1 PCR反应体系如下： 引物序列 ECAnsB-1: catgccatggatggagtttttcaaaaagacggc (Nco I) ECAnsB-2a: cccaagcttgtactgattgaagatctgctgga (Hind III) 10× PCR Buffer 5 μl dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 4 μl TaKaRa EX Taq（5 u/μl） 0.5 μl MgCl2 4 μl Forward Primer（20 μmol/L） 2 μl Reverse Primer（20 μmol/L） 2 μl DNA template (pET28a-AnsB) 1 μl Sterile distilled water up to 50 μl DNA的模版为质粒pET28a-AnsB（预先准备），程序名为Z1。 PCR 扩增程序：95 ℃，1.5 min； 95 ℃，30 sec， 52 ℃，30 sec， 72 ℃，1.5 min，30 cycles；72 ℃ 10 min。 1.2 电泳检测 电泳检测条件：1%琼脂糖凝胶电泳。 配制方法：50ml TAE缓冲液+0.5g 琼脂糖，微波炉加热沸腾至完全澄清，加入5μl GOLDWAVE染色液体，插入小梳齿。 点样：2.5 μl样品+1μl 6×或者10× Loading Buffer点样。 电泳时间：120V恒压 30 min 分子量Marker：