干细胞技术要点.ppt

三、干细胞应用（治疗失明） 首例利用胚胎干细胞医治失明手术在美实施 2011年7月15日 据美国《华盛顿邮报》及《技术评论杂志》，美国于近日正式进行了首例以人类胚胎干细胞医治渐进式失明患者的手术。这是美国食品和药物管理局（FDA）批准的第二起人类胚胎干细胞人体临床试验。而本次手术治疗备受重视，被认为是干细胞领域的重要里程碑，或将使饱受争议的人类胚胎干细胞研究证明其真实价值。位于麻省的先进细胞科技公司（Advanced?Cell?Technology）于当地时间7月14日宣布了该消息。该公司首席科学官、美国最著名干细胞研究学者罗伯特·兰萨在声明中指出：“干细胞的巨大潜力最终将被推上检验台。而两例临床试验的启动，成为该领域的一个重要转折标志。” 医生手持的针筒中装有由干细胞培育而成的视网膜色素上皮细胞。 手术现场 利用动物干细胞 培育出视网膜组织 2012年6月14日 日本再生科学综合研究中心教授笹井芳树领导的研究小组利用动物干细胞培育出视网膜组织，并发表在最新一期杂志《干细胞》上。研究小组利用小鼠的胚胎干细胞，成功地在试管中培养出了被称为“视杯”的视网膜组织，“视杯”是胚胎发育初期形成的视网膜结构。研究人员将“视杯”再持续培养两周后，形成了接近新生小鼠视网膜的组织。视网膜含有多种细胞的复杂构造，在以往的胚胎干细胞培育技术中，从未培育出如此复杂的组织。 基因打靶 （Gene targeting） 技术先进性 实现转基因定点整合 (一)基因打靶的原理 基因打靶(gene targeting)是根据DNA同源重组的原理而设计的一项技术。在这一技术中，体内细胞基因组的某一段DNA序列被视为“靶子”，经精巧构建的欲导入的外源基因DNA序列被视为“弹头”，这样导入的外源基因进入受体细胞后就不再是随机整合而是“弹头”锚准“靶子”进行准确的定点整合。 打靶载体(targeting vector)。 如何使外源基因能定点整合于靶基因上呢?根据DNA同源重组的原理，导入的外源基因必须和靶基因有一定的同源序列。因此，外源基因导入前必须经过精巧的构建，经构建的外源基因称为打靶载体(targeting vector)。 7 8 neo 8 9 6 7 8 9 7 8 neo 8 9 6 打靶载体 野生ES细胞 突变ES细胞 基因打靶的结局有如下可能： (1)基因击入(gene knock-in) 在受体细胞基因组中定点引入一个完全新的基因。 (2)基因敲除(gene knock-out) 受体细胞内源靶基因被灭活,。 (3)基因替代(gene replacement) 靶基因被导入的外源基因替代，可以是以正常基因替代突变的内源基因。 (二)基因打靶的方法： 进行基因打靶要经历以下步骤： （1）构建打靶载体。 （2）打靶载体导入受体细胞(常用胚胎干细胞(embryonic stem cell，即ES细胞)。 （3）打靶ES细胞导入囊胚。 （4）囊胚植入假孕母鼠子宫发育。 1. 打靶载体的构建： 基因打靶的关键在于构建打靶载体。在打靶载体中需要一个与靶基因同源的DNA片段，这一片段称为同源重组指导序(homologous recombination directing sequences, HRDS)。外源基因插入这一同源序列之中。长度可从3kb至15kb。 通过同源重组将外源基因导入固定位点,从而有目的的突变内源基因，图中单线表示内含子，框图表示外显子 7 8 neo 8 9 6 7 8 9 7 8 neo 8 9 6 打靶载体 野生ES细胞 突变ES细胞 2. 外源基因导入靶细胞： 基因打靶所使用的受体细胞一般用胚胎干细胞(ES细胞)，ES细胞是一种多潜能的干细胞，能在体外传代而不改变其多潜能性。小鼠胚胎干细胞是从着床前胚胎(孕3 － 5天)内细胞群分离的细胞。 1981年由英国剑桥大学的Evans和Kaufman首先分离培养成功。 英国卡迪夫大学(Cardiff University)卡迪夫生命科学学院Martin J. Evans 外源基因导入ES细胞的方法有: 1.电穿孔法 2.逆转录病毒载体法 3.脂质体包装法 4.磷