颌下腺组织工程物衍生支架材料的制备及生物学性质的实验研究.pdf

颌下腺组织工程生物衍生支架材料的制备 及生物学性质的实验研究 中文摘要 实验目的 由于各种疾病所致的涎腺分泌功能丧失，在临床上引起严重的I=I干症 状及干燥综合症，给患者带来极大痛苦，严重影响患者的生存质量，至今尚 无良好的治疗方法。组织工程学概念提出后，应用领下腺组织工程的方法， 构筑颌下腺组织器官，为治疗涎腺功能丧失所致的口干提供了新的思路和 方法。在涎腺组织工程研究中，作为种子细胞附着、增殖、分化提供营养的 细胞外基质支架材料，是组织工程研究的重点内容。目前常用的PGA、PLA 等支架材料虽然可以起到细胞代谢场所作用，但是由于其本身为人工合成 的高分子材料，属于异物，难免会引起机体的免疫排斥或感染。因此，寻找 纯天然的生物衍生支架材料的研究受到该领域学者的极大重视。 本研究的目的是利用异体颌下腺组织，经过多步骤的脱细胞处理，获得 纯天然的生物衍生支架材料。通过组织学和组织化学研究，分析脱细胞后 的生物衍生材料的组织成分；扫描电镜下观察支架材料的结构特点；通过体 内、体外的实验研究，分析颌下腺脱细胞生物衍生支架材料的组织相容性和 细胞相容性；用培养优化的颌下腺细胞进行复合培养，观察细胞在支架材料 上的生长情况；为颌下腺组织工程寻找合适的支架材料。 实验方法 1．应用化学除垢剂及酶消化的方法，对颌下腺组织进行脱细胞处理，制 备纯天然的生物衍生支架材料。 2．比较不同浓度TritonX一100对颌下腺组织进行脱细胞作用的影响。 3．应用组织学及组织化学的方法，对制备的颌下腺生物衍生支架材料 的基质成分进行分析。通过扫描电镜观察颌下腺脱细胞基质支架材料的组 织结构特点，并测量其孔径大小，同时计算其孑L隙率。 4．制备颌下腺脱细胞基质支架材料的浸提液，通过急性全身毒性试验， 分析脱细胞后的生物衍生支架材料对机体的毒性作用。 5．通过体内埋植试验观察颌下腺脱细胞基质支架材料对组织的影响， 判断该支架材料的组织相容性。 6．MTT比色法检测颌下腺细胞与支架材料体外复合培养第7天时的 吸光度值(OD值)，测定波长为490nm，检测细胞的存活率，通过计算细胞 的相对增殖百分率，判断该支架材料的细胞相容性。 7．应用胰酶消化法进行颌下腺细胞的分离、纯化，然后进行颌下腺细胞 的原代和传代培养，倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态结构。 8．将传代培养的第2代细胞与颌下腺脱细胞基质支架材料体外复合培 养，第3、5、7天时，通过扫描电镜观察颌下腺细胞在支架材料上的生长情 况，细胞的表面形态及结构特点。 实验结果 GlandAcellular 一、颌下腺脱细胞基质(Submandibular Mamx，SGAM)支 架材料的成分分析 在，细胞外观形态无明显变化。但细胞核有的固缩，有的碎裂，不规则，细胞 核排列无序，呈现拥挤状态；而3％TntonX—100脱细胞后的支架材料，颌下 腺细胞成分完全消失，光镜下见不到细胞核形态，粉红色的胶原纤维排列较 疏松，可见细胞脱除后遗留的陷窝，呈筛网状结构。 损，细胞器破坏、破碎，染色质凝集，形成多个散在的碎块，有的细胞核浓缩， 消失，只见残留的细胞轮廓，周边可见不同方向走行的胶原纤维断面。 胞后，见细胞完全消失，只残留空虚的陷窝，呈大小不等的坑穴状。基质胶 原纤维粗细不等，不同层面的胶原纤维走向不一，相互交错呈网状结构。经 测定其孔径在150—3001J,m之间，孔隙率为70％±7．25％。 ·2· 4，免疫组化检测：颌下腺脱细胞基质支架材料中，颌下腺细胞成分被完 全脱除，在保留下来的网状结构的框架中，其主要成分为I、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋 白及纤维粘连蛋白，这些蛋白成分在脱细胞过程中没有丢失。而作为支架 材料的主要成分保留下来，为细胞的附着、增殖、分化和营养代谢提供了良 好的环境和场所。 二、颌下腺脱细胞基质支架材料的毒理试验 1．急性全身毒性试验：按照生物学评价试验的要求及标准制备SGAM 支架材料的浸提液，通过大鼠尾静脉注射24h、48h及72h后，大鼠体重均