颞下颌关节骨关病基因治疗的动物实验研究.pdf

|!l|川大学华西口腔医学院博士论文 颞下颌关节骨关节病基因治疗的动物实验研究 导师李声伟教授 田卫东教授 博士生王栋 中文摘要 Mandibular 颞下颌关节(Temporal Joint，TMJ)是人体中功能与结构最复 杂的滑膜关节，它同其它滑膜关节相似，常易患骨关节病(osteoarthritis， OA)。以往研究证实，IL．1可能是OA发生发展过程中的中心调控因子， Interleukinl 人白介素1受体拮抗剂(Human 与IL．1具有同源性，能与IL．1受体结合丽阻断lL．1的受体后效应，是IL．1 的竞争性拮抗剂。近年来，利用基因转染技术以IL-1Ra为目的基因来拮抗 IL．1的作用，成为骨关节病治疗的新途径，越来越受到人们的重视。 目的在建立颞下颌关节骨关节病动物模型的基础上，研究基因治疗兔 TMJOA的方法，并检测基因转染的质粒在兔关节内是否持续、有效分泌 hlL．IRa蛋白来阻断IL-1的活性从而发挥其抑制软骨破坏的作用，同时考 察基因治疗的生物安全性，为探索合理的、有针对性的TMJOA的基因治 疗提供科学依据。 方法(1)l％II胶原酶注射入成年新西兰兔TMJ腚内，通过大体检 查、光镜组织学检查和扫描电镜检查，动态观察兔n噍J进行性关节病损发 展的情况。(2)20只成年新西兰兔随机分为四组，在诱麓骨关节病四周后， 第一组不接受治疗，第二组右侧颞颁关节腔内连续三次间隔24小时注射生 1 四川大学华西口腔医学院博士论文 理盐水内含阳离子脂质体LipefectinAmine Reagent介导的peDNA3．1质粒， 第三组关节腔内连续三次间隔24小时注射生理盐水内含阳离子脂质体介 导的100ughLI-lra基因的质粒，第四组关节腔内连续三次间隔24小时注 射生理盐水内含阳离子脂质体介导的200uhLI．1m基因的质粒。第六周 g 分别抽取各组关节滑液，第八周再次抽取关节滑液后处死动物。切取右侧 颞颌关节分别行大体、组织病理学、超微结构的观察来验证兔TMJOA是 否有好转；免疫组织化学方法来观察hlL．IRa基因的表达和定位；ELISA 法和Western Blot印记法鉴定关节滑液中hlL．IRa蛋白合成的变化以及定 原酶的情况下，按实验二的方法处理，四周后取兔身体其它部位的脏器(心、 肝、脾、肺、肾、胰)经RT-PCR来检测是否有hlL．1Ra基因的异位表达。 获取的心、肝、脾、肺、肾、胰标本大体观察有无变化后，接着进行常规 组织病理学方法检测基因治疗的生物安全性。 结果(1)所有实验侧关节均出现了关节退行性病损，并随观察时间 的延长而加重；发现在骨关节病的早期表现为关节表面的原纤维形成，软 骨变薄，基质分解破坏。以及后期骨质吸收破坏、骨质硬化、骨赘形成及 关节盘变形穿孔、玻璃样变等改变，还可见滑膜增生，炎症及退行性改变 等，与人类颞颌关节骨关节病的基本病理改变一致。(2)利用基医转染技 术来治疗兔颞颌关节骨关节病，大体观基因治疗组骨赘的宽度和病损的范 围明显减少，在组织病理学以及超微结构中发现治疗组中关节软骨和滑膜 的病损均得到改善，病情的好转与质粒DNA量的大小相关。关节滑液用 未治疗组和对照组，治疗组中第四组hlL—IRa蛋白表达量明显高于第三组 2 四川大学华西口腔医学院搏士论文 (pO05)，说明蛋白表达量与质粒DNA的量呈『F相关。治疗组中两周 hlL一1Ra蛋白表达量明显高于四周组(pO，05)，但在第四周时，仍有目的基 因表达。Western Blot印记法也可显示二周时第四组hlL一1Ra蛋白的存在。 免疫组织化学方法发现在兔颞颌关