放线菌素D诱导79细胞旁观者效应及其机制和旁观者因子筛选的实验研究.pdf

·中文论著摘要· 放线菌素D诱导V79细胞旁观者效应及其机制 和旁观者因子筛选的实验研究 刖 置 旁观者效应的发现由来已久，但研究几乎都集中在仪粒子、中子、T射线、X 射线等高能量的电离辐射所诱导的旁观者效应(bystandereffect，BE)上，对于非电 medium，CM)也能诱导旁观者效应。该结果提示除电离辐射外，非电离辐射等其 他理化因素也有引起BE的能力。由于BE是原有损害效应的延续与放大，其毒理 学意义受到人们的广泛关注。 而化学因素引起靶细胞的DNA损伤诱导旁观者效应的相关研究很少。直到近 几年才有三篇关于烷化剂的研究，发现化学物质也可能诱导旁观者效应。但其他 化学毒物(遗传物质损伤剂等)是否能引起旁观者效应及其特征尤其是发生机制 的研究几乎还是一片空白。旁观者效应的发生机制尚不十分清楚，经由不同途径 死亡的靶细胞所产生和释放的旁观者因子的性质更没有确定。 本课题主要就化学物角度，首次采用经典的致凋亡物质放线菌素D(Actino． 机制，并对旁观者因子进行筛选。 l、用不同剂量ActD处理V79细胞不同时间，观察各指标变化，确定最适的 条件来建立靶细胞凋亡模型，为后续研究靶细胞在凋亡过程中能否产生和释放引 起旁观者效应的因子以及效应因子的性质提供实验基础资料。 2、利用ActD所致V79细胞凋亡模型，取不同时段靶细胞去细胞培养液CM， 培养旁观者细胞，以存活率、死亡方式、染色体畸变、超微结构改变为检测终点， 确定凋亡进程中CM是否能够诱导旁观者效应及效应最强时段，为阐明DNA损伤 类型(凋亡)与旁观者效应之间的关系提供重要线索，为筛选旁观者因子打下基础。 3、采用CM培养旁观者细胞，观察不同时段CM对DNA损伤反应和凋亡关 位(△Vm)变化，推测线粒体通路在导致旁观者细胞凋亡中的作用及其他可能通 路的情况。为研究化学因素诱导旁观者细胞凋亡机制提供实验依据与资料。 TOF MS进行一级和二级质谱分析，以筛选和鉴定可能存在的旁观者因子。为确证 旁观者效应发生的确切机制提供重要资料和线索。 方 法 1、ActD所致V79靶细胞凋亡模型的建立 (1)细胞及培养 中国仓鼠成纤维细胞V79．C3细胞株(购自北京中国医学科学院基础医学研 培养箱内培养，隔天传代。 MTT法酶标仪上测细胞存活率； Annexin V．FITC／PI双染，流式细胞仪检测细胞凋亡／坏死率； 相差显微镜观察细胞形态学； 染色体畸变分析检测靶细胞染色体损伤： Hoechst33258染色；AnnexinVoFITC／PI双染，荧光显微镜下观察凋亡情况； 透射电子显微镜观察靶细胞超微结构的改变。 2、ActD处理V79细胞后CM诱导旁观者效应的实验研究 (1)不同时段去靶细胞培养液(CM)的获取 2 后，进行旁观者效应的观察。 去细胞培养液培养24h，观察指标与靶细胞相似： 相差显微镜观察细胞形态学并拍照。 MTT法测定细胞存活率。 常规的染色体畸变分析方法制片，在普通光学显微镜下观察染色体损伤。 AnnexinV-FITC／PI双染法流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 透射电镜下观察细胞超微结构的改变。 3、ActD所致V79细胞旁观者效应机制的研究 mRNA水平 (1)RT—PCR方法检测p53、Bcl一2、Bax mRNA水平。 加入设计的各引物，RT-PCR方法检测p53、Bcl．2、Bax (2)蛋自测定 将处理后的细胞爬片丙酮固定，参照SABC试剂盒免疫组织化学染色法检测 旁观者细胞p53蛋白表达；对数期生长的正常细胞加入不同时段(4h、8h、12h、 24h)CM培养24h，Western (3)细胞周期测定方法 染色，流式细胞仪检测。计算G0／G1期，S期和G2／M期细胞数。 (4)流式细胞仪测定旁观者细胞RO