广西HIV-1时荧光定量PCR方法的建立及其初步评价.pdfVIP

及其初步评价 摘 要 目 的 建立简便、实用、适宜于广西HIV-1流行毒株的实时荧光定量PCR方 法，并对方法科学性进行评价。 方法 取HIV-1序列的保守区域序列。再利用PrimerExPress软件设计实时荧光定 量PCR引物和TaqMan探针。 Vector连接成重组质粒，转化 进行扩增，扩增产物回收纯化后与pMDl8．T 到大肠杆菌JM109中，联合应用蓝白筛选、酶切、基因序列分析方法鉴定 重组质粒。根据重组质粒的OD值换算出重组质粒的拷贝数，梯度稀释后 作为实时荧光定量PCR的标准品。 3、方法学评价应用设计的探针和引物初步建立实时荧光定量PCR检 测方法，调整并优化该反应体系。建立荧光定量PCR的标准曲线，评价该 方法的检测线性范围和检测下限、特异性、重复性等指标。 载量检测方法对56例HIV-1感染者的病毒载量进行检测，检验两种方法在 检测率和病毒载量等级差异，考察两种方法的一致性和相关性。 5、亚型适宜性评价把56份样本按照不同亚型归类，根据样本的病毒 2 载量检测结果，分析荧光定量PCR方法对不同亚型的检测效果。 6、国际参考品评价运用实时荧光定量PCR方法对15例国际参考品 进行双盲检测，评价该方法对不同亚型和不同浓度样本检测的准确性和适 用性。 7、国内标准方法比较采用匹基公司的HIV核酸定量检测试剂盒和本 研究建立的方法同时对72例现场收集的HIV-1感染者标本进行检测，并进 行比较，初步了解该方法与国内试剂盒检测结果的一致性和相关性。 结果 引物。 2、标准品构建成功构建了包含广西HIV-1毒株序列的重组质粒标准 品，以10倍倍比稀释成不同浓度用于制作标准曲线。 1．5x 108拷贝范围内时，荧光 150copies／mL，当HIV-1标准品含量在1．5×102 定量PCR的标准曲线图显示Ct值与HIV标准品拷贝数的对数值之间具有 间变异系数为1．156％；试剂经反复冻融，还能达到较高的稳定性。 real—time xlog PCR拷贝数／mL值。 5、亚型适宜性评价荧光定量PCR方法能检出广西流行的B’、 3 致。 6、国际参考品评价经15个国际参考品检验，荧光定量PCR方法能 检出高于103拷贝数的各个样本，但对于小于103拷贝数的样本，不能完全 检出。 7、国内标准方法比较本研究建立的real．timePCR方法及匹基公司的 real．time 增大。 结论 建立的荧光定量PCR方法具有线性范围广，特异度高，重复性好，检测 下限低，检测试剂稳定性好，并与国际标准的NASBA法检测结果高度相关， 与国内标准的试剂盒产品具有较好的一致性，能适应广西地区不同HIV．1亚 型。因此，该方法实用、可行，在病毒载量检测、早期感染检测、治疗病 人的耐药监测等方面具有良好的应用前景。 关键词：HIV．1，荧光定量PCR，TaqMan探针，病毒载量检测 4 亡酉H!坠!塞吐夔羞定量匹B友鎏丝建童霆基翅垄迁俭 2Q竖级亟±硒塞生堂焦途塞 DEVELoPMENTANDPRELIMINARY oFTHE REAL．TIMEPCRASSAYFORTHEHUMAN IMMUNoDEFICIENCYVIRUSTYPE1IN GUANGⅪ ABSTRAC