视黄酸依赖FaRARα融合基因表达载体构建及其诱导肿瘤细胞凋亡的研究.pdf

Q融合基因表达载体构建及其 视黄酸依赖Fas／RAR 诱导肿瘤细胞凋亡的研究 摘 要 肿瘤发生机制及治疗对策的研究是当今医学研究的重点，其中以诱导 分化治疗、基因治疗和“启动细胞天然自杀机制～…细胞凋亡”三大治疗 acid，RA)是维生素A的体内活性代 模式尤为引人注目。视黄酸(retinoic 谢产物，具有多种生理生化功能。RA的许多生物学效应是通过其胞内核 受体介导的，视黄酸核受体可分为RAR和RXR两个超家族，每个超家族 都含有o、p和y三个成员。RA与其受体的同源或异源二聚体 (RxR／IⅨR、RAR／RXR)结合后，活化的受体能与靶基因上的视黄酸反 acid 应元件(retinoic element，RARE)结合而调节下游基因表达。 response 近年来通过体内外及临床实验研究表明，RA可抑制肿瘤细胞增殖、诱导 肿瘤细胞分化和凋亡。目前全反式视黄酸(ATRA)和13顺式视黄酸 (13-cRA)已用于血液肿瘤、肺癌、肾癌、黑色素细胞瘤、神经胶质细 胞瘤等多种癌症的临床治疗，并取得了较好的疗效。组是，近年来发现应 用RA治疗存在一定的缺点，即易复发或肿瘤患者对虫A出现抵抗或耐药， 推测其机理可能与视黄酸胞内核受体RAR基因易位和／或突变，以及异 常融合基因的形成有关，但确切分子机制尚不清楚，因此探索克服RA耐 药的方法、发挥RA疗效具有重要的临床意义。 细胞凋亡(程序性死亡)是机体生长、分化、发育和病理过程中由基 因编码调控的细胞主动自杀现象，是近年来基础研究领域的热点之一，本 课题拟通过直接诱导肿瘤细胞凋亡，进而对分子机制尚不清楚的RA抗性 细胞进行有效治疗。 Fas抗原是细胞凋亡机制中启动凋亡的信号分子之一，亦称APO．1或 CD95，是与细胞凋亡密切相关的细胞表面分子之～，其与特异性配体FasL 结合后可诱导Fas(+)细胞的“自杀”，现已证实Fas诱发的细胞自杀与 domain，DD)”有关，Fas 其胞内60．70个氨基酸组成的“死亡区(Death 与抗一Fas或FasL结合能引起Fas死亡区交联或聚化，启动死亡信号传导， 引发下游凋亡效应的发生。RA与其核受体RARa的配体结合区(LBD) 作用可导致受体形成三聚体，根据这一特性推测构建含Fas抗原死亡区和 ＆～Ra LBD区的融合蛋白，外源性RA即可经RARa聚合作用启动融合蛋 白中Fas介导的死亡信号。本课题中构建含Fas死亡区和RARccLBD融 合基因表达载体的同时，在融合基因上游插入RARE调控序列的启动子， 使其自身表达亦受RA调控，转导肿瘤细胞后，进而观察RA依赖细胞凋 亡效应的发生，为克服RA抗性提供实验基础，并进一步分析凋亡发生的 分子机制。 本研究首先构建了含有RARE调控元件的绿色荧光蛋白(eGFP)报 告基因表达载体，并验证了RA可调控带有RARE的eGFP表达，初步确 定了该载体模型的可应用性：进而，应用DNA重组技术构建了带有RARE 的融合基因Fas／RAR a)，并采用RT．PCR 121表达载体(pRARE．Fas／RAR a转染细胞后融合基 和荧光显微镜直接观测方法证实了pRARE—Fas／RAR 因的表达受RA精确调控：同时运用MTT试验、TUNEL检测、透射电镜 观测、DNA梯形带检测、流式细胞分析、RT．PCR以及蛋白免疫印迹等 技术手段，探讨了I认及其诱导的融合基因Fas／RARa表达启动的凋亡效 应及其可能的分子机制。 本课题主要研究结果如下： 1．运用DNA重组技术构建了带有3个RARE重复序列的eGFP真核 2d，RT-PCR和荧光显微镜直接观测发现eGFP蛋白表达明显升高，撤除 RA处理因素后表达有所下降。提示RA可诱导带有RARE．TK启动子的 外源基因表达，且呈限时高效表达，推测以此为模板构建RA依赖融合基 因Fas／RAR