转基因水稻中标基因水平转移评价的系统生物学方法研究.pdf

中国疾病预防控制中心博士论文 转基因水稻中标记基因水平转移评价的系统生物学方法研究 中文摘要 标记基因目前广泛用于植物的遗传转化，随着转基因植物商品化种植，转基因植物 食品中标记基因能否水平转移至消化道微生物或上皮组织并成功结合和表达，成为需要 回答的潜在食品安全问题之一。因此，开展转基因植物食品中标记基因水平转移研究成 为转基因食品安全性评价的一个重要方面。 B 潮霉素B磷酸转移酶(hygromycin 抗生素选择标记基因，它来自Streptomyces 氨基糖苷4一磷酸转移酶。在植物转化中，潮霉素抗性基因(hp})的选择效率在某些作 物(如禾谷类)上较其他标记基因高。我国科学家研制出具有自主知识产权和产业化前 s86品系含hpt和去标记产品为范例，利用基因稳定性、缺失修复和蛋白质组表达差异， 对标记基因安全性评价方法进行研究。 1．利用自行设计的定性PCR和实时定量PCR扩增体系，对hpt在不同加工条件和 体外模拟消化条件下的稳定性进行了研究，以确定其发生水平转移的可能性是否存在。 段已降解。对照M86大米加工米饭和粥仅能扩出植物叶绿体基因rbcl片段，爆米花、 锅巴及空白对照所有扩增均为阴性。利用定性PCR体系和实时定量PCR体系对体外模拟 消化道样品进行扩增，结果显示经过加工和／或胃肠道的作用以后，助t基因已降解成 较小片段，从量上来讲绝大部分也已降解。表明助t在转基因大米加工食品中均已不 同程度的发生了降解，不同加工方式对hpt片段降解影响显著，经过加工和／或胃肠道 的作用以后，hpt基因已降解成较小片段，从量上来讲绝大部分也已降解，以较大或 完整片段向食品或消化道微生物转移的可能性减小。 2．自行构建了基于同源重组的标记修复系统开展DNA的转化能力研究。以含hpt coli coli 缺失片段的受体菌E JMl09(重组酶基因缺失的工程菌)和EMGl655(野生 型)为受体菌构建标记修复系统；以含完整助t片段的PCR产物、转sck基因水稻基因 组DNA和供体质粒对受体菌进行转化实验，在实验室条件下没有观察到标记修复的发 2 中国疾病预防控制中心博士论文 生。用枯草杆菌构建的标记修复系统正在构建中。 3．建立了水稻2种组织样品(大米和叶苗)和加工米饭蛋白样品制备方法，以转sck 对象，应用PCR技术及双向凝胶电泳(2DE)与基质辅助激光诱导解离一串联时间飞行质 2DE后银染胶的比对，在水稻叶苗、大米、米饭样品分别与亲本对应样品间不仅均有蛋 白点表现为量和质的变化，而且在各组内蛋白点的变化与亲本相比具有差异点显现比较 大米进行全蛋白质组学测定，结合银染胶比对结果，发现转基因水稻中本身具有的4个蛋 白OsⅢBa00380lO．14(a一淀粉酶)、putativetriosephosphate 更多差异，可能与标记基因的剔除操作有关，其中的4个差异点有待进一步研究。PCR扩 白质组质谱鉴定结果并未检测到这三个基因表达产物，其原因可能是由于水稻种子处于 休眠状态，基因转录水平低，从而导致蛋白表达水平低。这也间接表明所评价转基因水 稻蛋白表达的选择性，稻谷更加安全。 在转基因操作过程中，多个拷贝的外源基因或者基因片段经常随机插入作物原有基 因中，有可能造成原有基因的缺失或重排，产生非期望效应。这些效应包括干扰或破坏 原有基因功能，甚至发生基因沉默，形成新的代谢物或者改变已有代谢物水平，进而有 可能导致未知有毒物质、抗营养物质以及致敏物质的出现。非期望效应的评价就成为转 基因食品安全性评价的重要内容。本研究方法的初步建立将对非期望效应的评估提供有 力手段。 关键词：转基因标记基因潮霉素水平转移非预期效应水稻蛋白质组 系统生物学 3 中国疾病预防控制中心博士论文