鼠疫耶尔森氏菌因组多态性研究及快速鉴定溯源系统的建立.pdf

中文摘要 摘 要 鼠疫耶尔森氏菌基因组多态性研究及 快速鉴定溯源系统的建立 鼠疫是一种流行在啮齿动物间通过跳蚤传播的自然疫源性疾病，鼠疫耶尔森 氏菌(Yersinia pestis，以下简称鼠疫菌)是鼠疫的病原菌，在历史上曾经引发三 次世界范围的鼠疫大流行，给人类带来巨大的灾难。近年来，鼠疫在亚非地区的 流行有增无减，动物间疫情呈活跃态势，鼠疫的防治仍是不容忽视的问题。另外， 鼠疫菌也是生物武器缔约国专家组所确定的标准生物战剂，非常有可能应用于生 物战和生物恐怖袭击，因此对鼠疫菌进行基因组多态性研究，建立多态性数据库， 对疫情爆发和生物恐怖袭击发生时鼠疫菌的快速鉴定溯源具有非常重要的意义。 鼠疫菌在进化过程中基因组不断发生变异以适应新的生态位，逐渐形成具有 不同特点的鼠疫菌菌株。细菌基因组变异的主要分子策略包括点突变，基因的获 得和缺失、基因重排和重复序列拷贝数变化，本研究针对各种基因组变异形式设 计了不同的分子生物学实验方法，系统地考察了鼠疫菌基因组多态性，筛选出精 简有效的的分子靶标，建立了中国鼠疫菌快速鉴定溯源系统。同时，通过大量数 据分析，深入探讨了鼠疫菌的适应性进化以及与之密切相关的鼠疫自然疫源地形 成与扩张过程。 基于SNPs分析的鼠疫菌遗传关系框架的构建 Nucleotide 单核苷酸多态性(Single 标记，能够用来推测物种进化方向和进化年代，已经广泛应用于生物遗传关系的 盖4个生物型，分离自不同疫源地和宿主的代表性菌株进行了分析，将其分成12 个SNPs型，建立了基于45个SNPs的鼠疫菌遗传关系框架，将鼠疫菌分成3个 进化分支，与假结核耶尔森氏菌相比，Branch0中SNPs突变最少，认为是一个 比较古老的分支，其中包括了0．PE4型的田鼠型菌株和较为古老的0．PE5和0．PE6 型的古典型菌株；Branch1分支中包括了1．ORI的东方型菌株和与之关系密切的 1．ANT的古典型菌株；Branch2分支中包括了2．MED的中世纪型菌株和与之关系 密切的2．ANT的古典型菌株。该遗传关系框架的建立为使用其他遗传标记对鼠疫 菌进行多态性研究提供了遗传关系上的参考。 中文摘要 基于基因获得和缺失的鼠疫菌基因分型系统的完善 在本实验室前期研究中，通过芯片比较基因组学分析和抑制消减杂交技术 Subtractive (Suppression 段(Different 据进行补充验证，对最终909株鼠疫菌的DFR数据进行全面系统的分析，完善了 基于DFR中国鼠疫菌基因分型体系，将909株中国鼠疫菌代表株分成32个基因 组型，同时提出了主要基因组型和次要基因组型的概念，主要基因组型呈明显的 疫源地特异性，但是鉴于DFR分型方法分辨率低的局限性，仍存在不同疫源地的 菌株具有同一基因组型的情况。通过与完成测序的鼠疫菌及假结核菌DFR谱的比 较，我们得以在一定程度上探讨了中国与国外鼠疫菌的差异，得出一系列有意义 的推论：基于减数进化的理论，本研究的结果显示中国的东方型菌株较国外的东 方型菌株古老，支持了东方型菌株起源于中国的推论；新疆鼠疫菌的DFR谱呈现 出高度的多态性，说明新疆是中国与中亚鼠疫菌频繁交换传播的通道。DFR分型 方法操作简便，成本低廉，适用于大量菌株的快速分型，随着尽可能多的新DFR 的鉴定，DFR分型方法会日臻完善。 基于串联重复序列的鼠疫茵基因组多态性研究 鼠疫菌是一类比较年轻的菌种，进化时间短，基因组中还没有积累足够多的 变异，因此需要一种多态性高的遗传标记来区分近缘菌株。本研究采用高分辨率 的MLVA(multi．10cusVNTR analysis，多位点串联重复序列分析)方法，对鼠疫 NumberofTandem 菌基因组中可变数目串联重复序列(Variable Repeat，VNTR) 进行深入系统的研究。 目前在鼠疫菌MLVA研究领域中有两套较为常用的位点，一套是法国第十一 胶电泳分析的25个位点，对383株