姜黄素诱导人乳癌细胞mcf-7凋亡及其机理的研究.pdfVIP

姜黄素诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡及其机理的研究 南京中医药大学第一临床学院 博士研究生韦达 指导老师 潘立群 摘 要 姜黄素的抗肿瘤作用日益引起人们的重视，已成为肿瘤预防和治疗的一个研 究热点。近年来，国内外的研究已使姜黄素的抗肿瘤作用初露端倪。研究表明， 姜黄素可以抑制多种肿瘤细胞系的生长。但姜黄素抗肿瘤机制较为复杂，在不同 的细胞类型中表现出不同的效应，诱导效应产生的分子机制也不尽相同。到目前 为止，姜黄素抗肿瘤机制尚未为人们系统、明确地了解，还有待进一步的研究。 所以，我们以此立题，希望通过检测姜黄素给药后细胞凋亡、周期阻滞相关 的基因和蛋白的变化来确定药物的作用靶点和通路。本研究中涉及到的方法主要 tern 有细胞培养、MTT法、RT-PCR、流式细胞术、WesBlot等。我们观察了姜黄 素对乳腺癌细胞MCF-7生长的抑制作用，及其对细胞增殖周期各时相的影响。通 过检测细胞凋亡的发生率，应用分子生物学手段分别从基因、蛋白和酶三个水平 对姜黄素诱导MCF-7细胞凋亡及产生周期阻滞的分子作用机理进行探讨，验证姜 黄素对MCF-7细胞凋亡、周期阻滞相关基因和蛋白表达的影响，明确药物作用的 抗肿瘤分子通路，旨在为今后乳腺癌的治疗提供一定的理论依据。 1、姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制作用 采用MTT法和光镜观察研究姜黄素体外对乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用，结 果显示，姜黄素对体外培养人乳腺癌细胞MCF-7具有明显的增值抑制作用，并呈 时间、剂量依赖关系；形态学观察结果显示，与空白对照组相比，姜黄素可显著 抑制MCF-7细胞的生长，加药后细胞增殖减慢，变小，胞膜皱缩，漂浮，并且随 着药物浓度的提高，细胞碎片逐渐增多。 2，姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡诱导作用 姜黄素对MCF-7细胞凋亡的诱导作用，结果表明，姜黄素可诱导MCF-7细胞凋亡， 出现明显的凋亡特征：核固缩、碎裂；琼脂糖电泳结果呈现明显的梯状条带； Annexin-V／PI双染流式细胞术检测结果显示I5州姜黄素作用24h、48h、72h后 MCF-7细胞的凋亡率为12．58％、16．25％和25．61％。 3、姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡诱导作用的机理研究 3．1姜黄素对MCF-7细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2的影响 5 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞，1u 检测。实验结果表明姜黄素能够影响人乳腺癌细胞MCF-7细胞凋亡相关基因bax 和bcl-2mRNA的表达。随着15¨M姜黄素与人乳腺癌细胞MCF-7细胞共同孵育 时间的延长，bc卜2基因的表达逐渐减少；而bax基因的表达呈上升趋势。姜黄 素可以增强Bax基因mRNA表达、抑制bci-2基因mRNA的表达。 3．2姜黄素对MCF-7细胞凋亡相关蛋白的影响 3．2．1姜黄素对MCF-7细胞凋亡相关蛋白Bax、Bel一2的影响 5 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞，1uM姜黄素作用24h、48h、72h后，收集 blot 细胞，采用Western 的影响。结果显示，姜黄素可明显促进Bax蛋白表达，降低Bcl一2蛋白的表达。 3．2．2姜黄素对MCF-7细胞中凋亡相关蛋白P53的影响 blot 采用WesternS方法检测姜黄素对凋亡相关基因P53蛋白表达的影响， 结果表明，MCF-7细胞经姜黄素作用后，P53蛋白表达明显上调。 3．2．3姜黄素对MCF-7细胞中凋亡相关蛋白细胞色素c的影响 blot 采用WesternS方法检测姜黄素对线粒体中细胞色素C蛋白含量的影响， 结果表明，MCF一7细胞经姜黄素作用后线粒体中的细胞色素C蛋白含量明显下降， 而胞浆中的蛋白含量上升。 3．3姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞caspase一3活性的影响 分别采用WesternblotS方法和Caspase-3kit研究姜黄素对MCF-7 assay 活性显著增强，并随姜黄素浓度增