制药专业生化实验指导书.docVIP

《生物化学》实验指导书 适用专业: 制药工程 生物化学实验细则 为了保证生物化学实验的顺利进行，培养同学们掌握良好、规范的生物化学基本实验技能，特制定以下实验细则，请同学们严格遵守。 实验前应提前预习实验指导书并复习相关知识。 严格按照生物化学实验分组，分批进入实验室，不得迟到。非本实验组的同学不准进入实验室。 进入实验室必须穿实验服。各位同学进入各自实验小组实验台后，保持安静，不得大声喧哗和嬉戏，不得无故离开本实验台随便走动。绝对禁止用实验仪器或药物开玩笑。 实验中应保持实验台的整洁，废液倒入废液桶中，用过的滤纸放入垃圾桶中，禁止直接倒入水槽中或随地乱丢。 实验中要注意节约药品与试剂，爱护仪器，使用前应了解使用方法，使用时要严格遵守操作规程，不得擅自移动实验仪器。否则，因非实验性损坏，由损坏者赔还。 使用水、火、电时，要做到人在使用，人走关水、断电、熄火。 做完实验要清洗仪器、器皿，并放回原位，擦净桌面。 实验后，要及时完成实验报告。 实验一 （4学时） 目的要求 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 . 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。3. 了解蛋白质变性与沉淀的关系。 1．可逆沉淀反应 在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）并不析出，因此，变性蛋白质不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 ml/组 取5ml鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4—8层纱布过滤，新鲜配置。 2. 蛋白质氯化钠溶液：3ml/组 取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。 3. 其余试剂： 硫酸铵粉末（10克/组），饱和硫酸铵溶液(150ml)，3%硝酸银（280ml），0.5%乙酸铅（200ml），浓硫酸（5ml/组），5%磺基水杨酸（100ml），0.1%硫酸铜（100ml），饱和硫酸铜溶液（400ml），0.1%乙酸（500ml），10%乙酸（500ml），饱和氯化钠溶液（25ml），10%氢氧化钠溶液（500ml）。 二、器材 试管（15支/组），过滤漏斗（1个），试管架1个/组，玻璃棒1支/组，沸水浴4台，量筒（总需要20ml×1,200ml×1），烧杯（总需要100ml×2，400×2），试剂瓶（12个/组，附胶头滴管10支/组），移液管（5ml×6/组，1ml×3/组），滤纸1盒，洗瓶1个/组，废液缸1个/组，药匙1个/组，移液管架1个/组 操作方法 一、蛋白质的可逆沉淀反应—蛋白质的盐析作用(分级盐析) 二、蛋白质的不可逆沉淀反应 1. 重金属沉淀蛋白质 2. 酸沉淀蛋白质 1） 2） 3. 加热沉淀蛋白质 取5支试管，编号，按下表加入有关试剂（单位/滴）。 蛋白质溶液 0.1%乙酸 10%乙酸 饱和氯化钠 10%氢氧化钠 蒸馏水 1 2 3 4 5 10 10 10 10 10 — 5 — — — — — 5 5 — — — — 2 — — — — — 2 7 2 2 — 5 将各管混匀，观察记录各管现象后，放入沸水浴中加热10min，比较各管的沉淀情况。 思 考 题 1. 名词解释：水化层；双电层；蛋白质变性；盐溶与盐析；蛋白质等电点沉淀。 2. 将实验结果写在实验报告中操作方法的对应位置上并就实验现象作简要解释。 3. 根据实验现象，讨论下列问题： 蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的本质区别是什么？ 简述蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的相互关系。 4. 作为杀菌剂，氯化汞是怎样起作用的？ 实验二 DNA的琼脂糖凝胶电泳 （4学时） 目的要求 1. 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法。 2. 学习利用琼脂糖电泳方法测定DNA片段大小。 3. 学习有关建立DNA限制性内切酶图谱的基本技术。 原 理 DNA分子在碱性环境中（pH8.3缓冲液）带负电荷，外加电场作用下，向正极泳动。不同的DNA片段由于其电荷、分子量大小及构型的不同，在电泳时的泳动速率就不同，从而可以区分出不同的区带，电泳后经溴乙锭染色，在波长254nm紫外光照射下，DNA显橙红色荧光。 琼脂糖凝胶电泳对DNA的分离作用主要依据DNA的分子量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。一定大小的DNA 片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中，电泳迁移率不相同。不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离DNA片段大小范围见表1。因而要有效分离大小不