TMV、PVM和CMV干扰载体构建及对人参果遗传转化.pdfVIP

４４ 核 农 学 报　 ２０１４，２８（１）：００４４ ～００５１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＮｕｃｌｅａｒＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 文章编号：１０００⁃８５５１（２０１４）０１⁃００４４⁃０８ ＴＭＶ、ＰＶＭ和ＣＭＶ干扰载体构建及对人参果遗传转化 １，２，３ ３ １，２，３ １，２，３ １，２，３ １，２，３ 高宜峰 　 张菲菲　 张金文 　 陆艳梅 　 魏桂民 　 马廷蕊 １ ２ （ 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州　 ７３００７０； 甘肃省干旱生境作物学 ３ 重点实验室，甘肃 兰州　 ７３００７０； 甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州　 ７３００７０） 摘　 要：人参果是以营养器官繁殖为主的多年生草本植物，连年种植易造成多种病毒病积累。 为了寻求 一种能同时抵御多种病毒病的方法，本试验以危害人参果的３种主要病毒为研究对象，根据ＧｅｎＢａｎｋ 中 烟草花叶病毒（ＴＭＶ）Ｐ１２６基因、马铃薯Ｍ病毒（ＰＶＭ）ＣＰ基因和黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）２ｂ蛋白基因序 列，利用Ｅ⁃ＲＮＡｉ 网站提供的分析软件，筛选出含有较多有效小干扰 ＲＮＡ［ｓｉＲＮＡ，１９ ｎｔ］的长ｄｓＲＮＡ （Ｌｏｎｇ ｄｓＲＮＡ）片段作为ＲＮＡｉ 的靶序列。 用重叠延伸ＰＣＲ方法将三个靶标片段融合在一起，构建了一 种具有内含子（ｉｎｔｒｏ）的反向重复结构和嵌合基因的植物ＲＮＡｉ表达载体ｐＣＥＩＨＦＲ。 将ｐＣＥＩＨＦＲ通过 冻融法导入农杆菌ＬＢＡ４４０４ 并转化人参果，经过草甘膦筛选和ＰＣＲ检测，确认其中的２４株为转基因阳 性植株。 关键词：烟草花叶病毒；马铃薯Ｍ病毒；黄瓜花叶病毒；ｉｈｐＲＮＡ；转基因人参果 ＤＯＩ：１０：１１８６９／ ｊ．ｉｓｓｎ．１００⁃８５５１．２０１４．０１．００４４ 　 　 人参果（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｕｒｉｃａｔｕｍＡｉｔ． ）系茄科直立半木 ＲＮＡ 干扰（ＲＮＡｉ）是指生物体内的双链 ＲＮＡ 质化、高度杂合体的多年生草本植物，从栽培品种的果 （ｄｓＲＮＡ）在ｍＲＮＡ 水平上靶基因表达关闭或沉默的 实中获取的种子不能繁殖纯种，较少用于生产，通常采 ［１］ 过程 。 已有的研究表明，将不同植物病毒的有效核 用扦插或者体外微繁技术繁殖。 人参果果肉清香多 酸（ｃＤＮＡ）片段拼接成嵌合基因，构建成具有特殊结 汁，低糖、低脂肪，富含硒和钼等多种微量元素，老少皆 构的植物ＲＮＡ干扰表达载体转化植物，可以获得同时 宜食用。 人参果的成熟期比其他已知的茄科植物（如 抗多种病毒病的转基因植株［２－４］。 研究表明，靶标片 茄子、辣椒和西红柿等）更长，在我国北方多以温室栽 段的来源［５－６］ 以及载体的插入片段结构［７－１０］ 影响 培为主，植株能够连续生长结实近１０ 年。 然而，不规 ＲＮＡｉ效率。 本试验综合考虑前人研究成果，构建了优 范的无性繁殖及连年高温高湿的栽培环境使田间病毒 化插入结构的ＲＮＡｉ植物表达载体，通过转化人参果 病的发生流行日趋严重。 验证，获得了２４株转基因阳性植株，为后续病毒侵染 调查研究发现，甘肃省河西走廊的人参果种植区 实验及获得抗病毒人参果植株奠定了基础。 域出现了大面积病害，表现为植株矮化、节间变短；叶 片皱缩、呈黄绿相嵌的斑驳状；果实僵化、畸形，品质退