半滑舌鳎(Cynoglossus+semilaevis)雌性特异fosmid片段筛选与FISH定位.pdfVIP

i semilaevis)雌性特异fosmd片段的筛 半滑舌鳎(Cynoglossus I 选与FSH定位 摘要 semilaevis)是我国传统经济鱼类，因其肉质鲜美营养 半滑舌鳎(Cynoglossus 丰富而深受喜爱。目前半滑舌鳎已实现工厂化养殖，但对其基因组及性染色体的 研究依然较少。本研究通过对已建成的fosmid文库进行有序混合，构建了fosmid 文库的两步一三维-PCR筛选系统。同时通过筛选半滑舌鳎w染色体文库，找到一 对雌鱼特异性引物，使用该引物对fosmid文库进行筛选，获得一个包含该引物 序列的阳性克隆，并使用荧光原位杂交技术将该克隆定位到半滑舌鳎w染色体 上。主要结果如下： 1、。半滑舌鳎fosmid文库筛选系统的构建与验证 级池与相应二级池。以每20个96孔板构建一个超级池、8个行池、7个列池及 20个板池。每个超级池含有该20个板的所有菌(1920个)。最终得到10个超 级池及350个二级池。超级池构建完成后，使用实验室已有的7个半滑舌鳎功能 基因引物对超级池及其二级池进行了筛选，筛选结果表明所有基因均能筛到两个 以上的阳性克隆并准确定位到fosmid文库中，表明所构建的两步一三维-PCR筛 选系统可以满足基因筛选的需要。 2、W染色体特异性片段的筛选及FISH定位 通过对半滑舌鳎w染色体文库进行测序、引物设计，获得210对引物，使用 这些引物分别对半滑舌鳎雌、雄鱼基因组DNA进行PCR筛选，最终得到1对在雌 鱼中扩增有条带而雄鱼中扩增无条带的引物，长度为239bp。使用该引物对10 雄10雌基因组DNA进行PCR筛选，验证了其w染色体特异性。使用该引物对 fosmid文库进行筛选，成功将一个包含该引物序列的阳性克隆定位到fosmid文 库中。随后通过荧光原位杂交技术将该克隆定位到半滑舌鳎染色体分裂相上。在 所有分裂相中，FISH杂交信号仅出现在w染色体的中部位置，证明了该引物的 W染色体特异性。 本研究获得的W染色体特异性引物可以通过简单的PCR反应快速鉴别半滑舌 鳎生理性别，对于半滑舌鳎的伪雄鉴别及全雌育苗具有极大的推动作用；同时通 过fosmid文库筛选获得的w染色体特异性克隆对于后续的w染色体及其基因研 究、构建w染色体重叠群contigs等工作具有重要的意义。 关键词：半滑舌鳎，fosmid文库，超级池，荧光原位杂交 andFISH ofa Screening Locating Cloneof Fosmid Half-smoothSole Tongue Abstract Half-smooth atraditionaleconomic tonguesole(Cynoglossussemilaevis)is flatfishinChina．Itembracesbotllnutrientandeconomical its studieson value，but its andsexchromosomesare and functionsare tobe genome rarelyreportedgene yet revealed．A was constructedbased 2-step-3D-PCRscreeningsystemsuccessfully female