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2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。 3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。 4. 反应条件：PCR扩增仪 94℃30″，55 ℃ 30 ″，72 ℃ 1′， 35个循环，72 ℃延伸 5 ′。 五、PCR反应条件优化： 1、温度、循环参数： ⑴ 变性温度和时间： 保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。 加热90～95℃，30 ～ 60 s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94 ℃ 30 ″，可使各种复杂的DNA分子完全变性。 温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。 ⑵ 复性温度和时间： PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。 复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，长度在15 ～ 25 bp 之间时，复性温度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 计算得到，一般位于40 ～ 60℃，30 ～ 60 s。 复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。 一般情况下选择55 ℃ 30″，足以使引物与模板之间完全结合。 ⑶ 延伸温度和时间： 一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间。 引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 ～ 75 ℃。 延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定， 1Kb，1分钟足够； 1Kb需加长延伸时间，10Kb片段延伸时间可达15分钟。 延伸时间过长可出现非特异扩增，常用72 ℃ 1′。 ⑷ 循环数： 其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。 理论上说20 ～ 25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20 ～ 30次是比较合理的循环次数。 循环次数越多，非特异扩增增加。 2、MgCl2浓度： 可显著影响PCR的产量及产物特异性 1.5 ～ 2.0 mM 过高：增加非特异扩增并影响产率 过低：酶活性显著下降。 3、引物： 0.2 ～ 1 μM 偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物 之间形成引物二聚体，产量降低。 偏低：产量降低。 引物设计原则： 总原则是提高扩增的效率和特异性 引物设计原则 ⑴ 长度15～30 b，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。 ⑵ 引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物 G+C 含量宜在45 ～ 55%左右。 ⑶ 引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构，两个引物之间尤其在 3’ 末端不应有互补链存在，不然会形成引物二聚体。 引物设计原则 ⑷ 引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性(70%)或少于连续8个的互补碱基。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。 ⑸ 引物的 5′ 末端碱基：并没有严格的限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，其 5′ 末端碱基可以不与模板DNA匹配呈游离状态。最多可游离10个碱基并不影响PCR反应进行。 引物设计原则 ⑹ 引物的 3′ 末端碱基：原则上要求引物的3′末端与模板DNA一定要配对，另外 3′末端的末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。 引物3′末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异，最好选T、G、C，而不选A。 六、PCR扩增产物的分析 1、凝胶电泳分析法： 聚丙烯酰胺凝胶电泳灵敏度远高于琼脂糖电泳， 用于探讨PCR扩增的灵敏度效果好，但配制复杂， 常用琼脂糖凝胶电泳。 2、点杂交 3、微孔板杂交法 七、PCR技术的主要用途 1、目的基因的克隆：