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园艺植物快繁与脱毒技术 任务三、外植体的选择和处理 学习目标：学习外植体的取材方法及外植体褐变和玻璃化的处理方法 任务要求: 能够对外植体进行选择及处理，能够对掌握试管苗的驯化基本步骤，能够对外植体的褐变及玻璃化采取相应的处理方案。 学习内容： (1)外植体的取材方法；(2)掌握外植体的消毒及处理(3)无菌接种的步骤(4)外植体的培养方法和步骤；(5)试管苗驯化的基本程序； (6)外植体褐变和玻璃化的处理； 学习情境 情境一：外植体的选择 子情境一：外植体的类型 子情境二：外植体的选择 情境二：外植体的处理 子情境一：外植体的消毒 子情境二：外植体的接种与培养 子情境一：外植体的类型 1、带芽的外植体 如茎尖和侧芽等，有两种方法培养这类外植体，一是诱导茎轴伸长，二是抑制主茎发育，促进腋芽最大限度生长，以产生丛生芽，为此则应在培养基中加入大量的细胞分裂素 2、有分化组织构成的外植体 如茎段、叶、根花茎、花瓣、花萼、胚珠、果实、花粉等，这类外植体大多有已分化的细胞组成 。 子情境二、外植体的选择 1、确定取材部位 一方面要考虑材料的来源是否有保证，另一方面也要考虑到经过脱分产生大愈伤组织是否会引起不良变异，丧失了原品种的优良性状，从而做到保质保量。 2、器官的生理状态和发育年龄 依据植物生理学的基本观点，同一植株上的器官具有不同的生理年龄，同种器的不同部位也具有不同的生理年龄。 3、取材的季节 大多数植物应在其生长的季节采样，处于生长末期或者已经进入休眠期的外植体对诱导反映迟钝或无反应。 4、离体材料（外植体）的大小 外植体大小要适宜。实验表明，外植体越小，其成活率越低；外植体越大，越容易造成污染。 5、取得离体材料的植株质量 只有具有优良性状的材料，才能繁殖出好的苗。 子情境一：外植体的消毒 一、常用的消毒剂 二、常用的消毒方法： 1、茎切段和叶片的消毒 2、果实和种子的消毒 3、根及地下贮藏器官的消毒 4、花药的消毒 子情境二、外植体的接种与培养 一、外植体的接种 1、接种室的消毒 接种前应进行地面的清洁工作，可用甲醛或高锰酸钾熏蒸。 2、外植体的分离、接种和培养 外植体材料的分离通常在无菌滤纸上进行。较大的材料肉眼观察即可分离，较小的则需在解剖镜下放大操作；    外植体的接种和培养 4、接种 （1）将初步洗涤及切割的材料放人烧杯，带入超净台上，用消毒剂灭菌 。再用无菌水冲洗，最后沥去水分，取出放置在灭过菌的4层纱布上或滤纸上。 （2）材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0．5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。 (3)用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。 二、外植体的培养 培养是指把培养材料放在培养室(有光照、温度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。 1、培养方法 (1)固体培养法即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法 (2)液体培养法即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。  外植体接种全过程 2、培养步骤 (1)初代培养 初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。 （2）顶芽和腋芽的发育 采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长，从而形成一个微型的多枝多芽的小灌木丛状的结构。 （3)不定芽的发育 在培养中由外植体产生不定芽，通常首先要经脱分化过程，形成愈伤组织的细胞。然后，经再分化 。 （4)体细胞胚状体的发生与发育 体细胞胚状体类似于合子胚但又有所不同，它也通过球形，心形，鱼雷形和子叶形的胚胎发育时期，最终发育成小苗。 酒精擦拭手 外植体消毒 浸泡5min 器械消毒 酒精灯灼烧 酒精擦拭培养皿 酒精擦拭 旋转灼烧 取外植体 修剪外植体 接种 盖好瓶塞