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分 子 生 物 学 (Molecular Biology) 周 伟 主讲 第六章 分子生物学研究法（下） ---基因功能研究技术 RNAi技术的应用--转基因西红柿 ACC，1-氨基丙环烷羧酸氧化酶，乙烯合成途径酶类 第一个上市的转基因植物 南京农业大学 生命科学学院 * * * * 第六章 分子生物学研究法（下） 原位杂交技术 基因敲除技术 凝胶滞缓实验 原位杂交：用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，主要分为RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类。 探针：是一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素（如P32）、萤光染料或酶（如地高辛，辣根过氧化物酶）标记成为探针。 原位杂交技术( in situ hybridization, ISH ) OsSi1 mRNA的互补链， 杂交信号集中于 纤维细胞中。 负对照，mRNA的同义链, 无杂交信号 正对照，UBQ10杂交信号遍布于 整个胚珠 荧光原位杂交：首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记， 然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定 的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的 单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的 位置。 荧光原位杂交( Fluorescence in situ hybridization, FISH ) 经典遗传学 (Forward genetics )：从一 个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。 现代遗传学 (Reverse genetics，反向遗传 学 ): 首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推测出基因的功能。 基因敲除 (gene knock-out)：又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。分为完全基因敲除和条件型基因敲除。 基因敲除技术 完全基因敲除：指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。 条件型基因敲除：指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。 基因敲除技术 用取代型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验 正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞 T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。利用农杆菌（根癌或发根）T-DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。 植物基因敲除技术 RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。RNAi的命名来源于安德鲁·法尔1998年在《自然》杂志上的 论文。 双链RNA是RNAi的触发物，引发与之互补的单链RNA（ssRNA, single-stranded RNA）的降解。 经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的双链RNA（30个核苷酸以上）首先被降解形成21～25个核苷酸的小分子干扰核糖核酸 (siRNA，small interfering RNA )有效定位目标 mRNA。 RNAi（RNA干涉）技术 RNAi作用机 制示意图。 过量表达：通过各种方式使基因的表达量超过组织正常需要量的技术方法。一般与高活性组成型强启动子或组织特异性强启动子融合，通过转化，获得该基因产物大量积累的转基因个体。 生物体各基因的启动子的效率可不相同，大肠杆菌的强启动子每2秒钟启动一次转录，而弱启动子每10分钟才启动一次，从百多个大肠杆菌启动子结构的分析，得知强启动子的同源序列的中心在转录起始位点(基因编码链上第一个核苷酸) 上游-10和-35个核苷酸处，弱启动子序列中往往有多处核苷酸被置换。 过量表达技术(over-expression) 南京农业大学 生命科学学院 * *