反义核酸与RNAi.pptVIP

RNA干扰RNA interference，RNAi 生物技术史上革命性事件 概述 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。 目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，不同的资料对其定义的侧重点也不尽相同，如果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义： RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源的基因发生共同基因沉默的现象。 如果将其作为一门生物技术，则定义为 ： RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。 RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。 发现过程 共抑制现象的发现 RNAi研究的早期线索来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组,约根森（Jorgensen）研究小组 ,在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现: 他们设想将更多的色素基因注入矮脚牵牛植物体中，试图加深花朵的紫颜色，而结果出其预料，转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制。 加入 chalcone synthase基因 发现过程 Jorgensen 将这种现象命名为 共抑制(cosuppression) 因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。 发现过程 Quelling现象 并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象。 1994年意大利的Cogoni等,将外源类胡萝卜素基因导入链孢霉(Neurosporacrassa),结果转化细胞中内源性的类胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌转基因实验中这种共抑制现象被称 “quelling”（基因压制）现象。 发现过程 95年康乃尔大学的研究人员Guo(郭苏)和kemphues在秀丽线虫(C.elegans)中用反义RNA 阻止一些基因的表达，给对照组用正义RNA不但不增加该基因的表达，反而产生与反义RNA 同样的结果——特异性阻断该基因的表达，这个奇怪的现象直到3年后1998才被解开。 1998年Fire等发现将ds RNA注入秀丽线虫可显著抑制特定基因的表达，并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。 线虫体内的RNAi 线虫中RNAi效应的检测 （左面）两条线虫表现为绿色荧光蛋白（GFP）表达类型品系，该品系含有一个普遍性表达的GFP报告基因重组质粒（带有核内定位信号位点）。 （右面）喂食表达针对GFP的dsRNA的细菌后，整个虫体的GFP信号消失。 发现过程 将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫，却能高效、特异地阻断相应基因的表达。 实验证明双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后的反义RNA至少高几个数量 ，他们称此现象为ds RNA介导的RNA干扰（RNAi）。 Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, alth