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生物样品制备技术 1、前期准备（试剂瓶的清洗，液体的配制） (1)1/15M磷酸缓冲液 A液：KH2PO4 1.816g 100ML 双蒸水 B液： Na2HPO4 5.5g 双蒸水200ML PH值7.4 1/15MPBS液：A液19ML B液81ML (2)固定液的配制 戊二醛固定液：3%戊二醛（25%戊二醛水溶液 12ML 1/15MPBS液 88ML ) 多聚甲醛-戊二醛混合固定液：1/15 PBS 50ML 固定液中含2%多聚 10%多聚甲醛 20ML 甲醛 2.5%戊二醛 25%戊二醛水溶液 10ML 双蒸水加至100ML *配置10%的多聚甲醛溶液配置20ML 多聚甲醛粉末5g 双蒸水50ML 取5g多聚甲醛放进80ML烧杯内注入双蒸水50ML.必须在通风厨内加热到60度左右（温度不可再高，以免煮沸溢出）若用电炉加热，温度在60度左右可以拔掉插头，并且不停用玻璃棒搅拌至溶液为乳白色，多聚甲醛粉末溶解时，用滴管加1N NaoH，同时搅拌至溶液清亮，冷却待用。 （3）锇酸固定液： 2%四氧化锇原液 四氧化锇1g 放入干净棕色瓶内 双蒸水50ML 4度冰箱保存 (3)脱水剂的配制：50% 70% 80% 90% 100% 乙醇 100%丙酮 (4)包埋剂的配制：EPON-812 14 ml DDSA 6.2ml MNA 8.9ml DMP-30 4滴 固定液特点 （一）戊二醛 主要优点： 1.对组织的穿透力比四氧化锇较强，较快，故组织块可适当增大到数毫米而不影响固定效果。 2.组织在戊二醛固定液中保存较长时间（数周至数月），对精细结构保存并无不利影响。 3.对糖原，核蛋白，尤其对微管，内质网等细胞膜系统和细胞基质有较好的固定作用，从而弥补锇酸固定液之不足。 4.戊二醛不挥发，因此没有蒸发中毒的危险，但不要太多的接近或接触. 5.适用于进行超微细胞化学研究。 主要缺点： 1.戊二醛对脂质不起固定作用，用它固定的一些微细结构在脱水时可能被抽提而丢失，因此它也不适用于单独作电镜技术的固定剂。最好作为四氧化锇的前固定剂使用。 2.戊二醛没有“电子染色”作用，用它固定的样品反差较差。 3.戊二醛不影响细胞的渗透压，所以对缓冲液的渗透压，以及其他条件要求较高，固定效果与缓冲液有很大关系。 （二）四氧化锇 主要优点：是一种强氧化剂，对氮具有很大亲和力，能和 含氮的化合物蛋白质发生化学结合来稳定蛋白质，故而能够近乎完满的保存生物的微细结构。具有“电子染色“作用。 主要缺点：对于碳水化合物（糖类），核酸等的固定作用差。 常规透射样品的制备流程 （1）取材 动物样品 植物样品 细胞样品 取材注意事项：低温操作，快，准，小 （2）3%戊二醛前固定 （3）1/15M PBS液漂洗3次 10-15分钟/次 （4）1%四氧化锇后固定1.5h （5）1/15M PBS液漂洗3次 10-15分钟/次 （6）梯度脱水 50% ， 70% ，80% ，90%， 100% 乙醇10-15分钟/次，100%纯丙酮2次，10-15分钟/次 （7）1:1丙酮:EPON-812包埋剂浸透2h （8）包埋，35℃，24h，45℃，24h,68℃，24h聚合 （9）半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜下定位 （10）60-80nm超薄切片，枸橼酸铅，醋酸柚双染 （11）JEOL日本电子公司生产透射电镜观察 常规扫描样品制备流程 （1）取材 动物样品 植物样品 细胞样品 取材注意事项：低温操作，快，准，小 （2）3%戊二醛前固定 （3）1/15M PBS液漂洗3次 10-15分钟/次 （4）1%四氧化锇后固定1.5h （5）1/15M PBS液漂洗3次 10-15分钟/次 （6）梯度脱水 50% ， 70% ，80% ，90%， 100% 乙醇10-15分钟/次 （7）叔丁醇浸透2小时 （8）冷冻干燥 （9）