大规模的酵素精制.pptVIP

第四章 大規模的酵素精製 4.1 緒言 一、酵素的萃取和純化是相當新進且仍在繼續發展的新技術。 二、在大規模的量產上並不能與酵素和醱酵在其他方面的技術發展 並駕齊驅，其原因可能是在酵素的大規模萃取和純化的研究上 受到某些限制。這些限制有： 1.新鮮原料的需求 2.中間工廠的需要 3.高額的研究發展經費 4.操作和資料收集所需人力的需求 5.伴隨精密的生化工程資料所產生的問題 三、“大規模化”的定義： 係指至少一公斤以上的生物原料進行純化所得酵素及其程序步 驟而言。 * * 4.2 酵素萃取方法 一、本章所提的酵素純化大部分源自微生物。但對於源自於植物或動 物的酵素純化則有些差異。主要的差別在於植物或動物的胞內酵 素比細菌的胞內酵素容易溶解。 二、微生物的胞外酵素不須加以萃取。可用清潔劑來溶解細胞膜束縛 酵素，將酵素從植物或動物組織中釋放出來。 三、欲從微生物中釋放出酵素則需使用更劇烈的方法，但不適用在大 規模的純化上。一般用來瓦解微生物的方法，可用化學或物理技 術。 4.2.1 酵素萃取的化學方法 一、界面活性劑： 1.可在適當的PH值、離子強度和溫度下將細菌細胞溶解。分類如 下： (1).離子性界面活性劑： ?.十二烷磺酸鈉(sodium dodecyl sulphate，SDS) ?.十六烷三甲基胺溴(cetyltrimethyl ammonium bromide) (2).非離子性界面活性劑： ?.Tween ?.Triton X-100 2.離子性界面活性劑比非離子性界面活性劑更具有反應性，且會引 起脂蛋白的分解和酵素的失活。 二、溶菌酵素(Lysozyme)和EDTA： 1.溶菌酵素是源自母雞蛋白的商業化酵素，可用來水解菌體細胞壁 糖胜類(glycopeptide)成分中的?-1,4配糖鍵。 2.EDTA可使菌體溶解並且釋出胞內酵素。 3.溶菌酵素只能溶解革蘭氏陽性菌，而對革蘭氏陰性菌則須在EDTA 的存在下才能將菌體溶解。此種技術很少用於大規模的酵素釋 放，可能由於溶菌酵素價格昂貴所致。 三、滲透性衝擊： 1.利用滲透性衝擊來釋放E. coli和其它革蘭氏陰性菌的水解酵素是 相當理想的方法。 2.此一方法的優點在於大約5%之非所欲細胞蛋白的釋出，且主要來 自於核外胞質空間。 3.此一方法比起傳統菌體破解方法可增加萃取所得的核外胞質酵素 的比活性。 4.此種方法很少應用於大量的菌體破解，其原因是離心步驟過多， 且必須在低溫下處理大量液體。 四、鹼處理： 1.在高PH下會導致菌體的溶解，此種現象則可直接應用於大規模的 菌體處理。 2.而在PH 11.5 ~ PH 12.5中，於20~30分鐘內亦能保持穩定活性的 所欲酵素方能適用。 4.2.2 酵素萃取的物理方法 一、音波： 1.小規模的酵素純化，一般以超音波處理菌體懸浮液，即可打破少 量的細菌細胞。但無法成功用在大規模的菌體酵素釋出上。 二、固體剪力： 1.固體剪力用於瓦解少量冷凍菌體液，但不適用於大規模的處理。 三、金鋼砂攪拌法： 1.在添加玻璃珠或小金鋼砂下快速攪拌，能有效地將細菌或酵母菌 破碎。 2.此一方法來打破菌體只有應用在中規模的酵素製備上。 四、液體剪力： 1.細菌、少數酵母菌和真菌可利用高達200MPa的壓力來驅動菌體懸 浮液通過細孔，藉以瓦解其細胞。 2.細菌的瓦解和它的生長條件及菌齡有關： (1).靜止期菌體比對數期菌體需要更大的瓦解外力。 (2).革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽性菌更易瓦解。 4.3 酵素純化 一、均質菌體培養液的酵素純化可分為下列幾個步驟： 1.去除核酸 2.去除菌體殘骸 3.初期純化步驟，濃縮產物 4.使用層析技術的純化步驟：如離子交換層析法、親和力層析法、 膠體層析法。 5.後期濃縮及規格化 4.3.1 核酸的去除 一、由細菌均質培養液和少數動物組織的均質液中純化酵素，往往由 於核酸的存在導致均質液黏度的提升而增加純化的困難。 二、使用核酸酶 1.外核酸酶