第十八章电泳精要.ppt

电 泳 (electrophoresis） 内 容 基本概念、分类及原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 毛细管电泳 印迹法（转移电泳） 电泳技术的发明及发展 电泳（electrophoresis） 概念：带电颗粒在电场作用下，向与其电荷相反的电极移动的现象。 电泳的分类 显微电泳 自由界面电泳：在没有支持介质的溶液中进行的电泳 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散。是目前常用的电泳系统 区带电泳的其他分类 第一节 电泳的基本原理 电泳是在电场作用下产生的物质运动。 电泳的基本原理(1) 若将带净电荷q的颗粒放入电场，则受到的电荷引力为 F引=E·q 在溶液中,运动颗粒遵循Stoke’s Law（斯托克斯定律） F阻=6πrηV 当F引=F阻时 E·q = 6πrηV V= 电泳的基本原理(2) 颗粒的泳动速度与颗粒形状有关。 如非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力。 颗粒的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E)和颗粒所带电荷量(q)成正比,而与颗粒的半径(r)及溶液的粘度(η)成反比。 电泳的基本原理(3) 由（4）可知，带电颗粒的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电颗粒在不同电场里泳动速度不同，为了便于比较，常用迁移率 m（指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表示颗粒的泳动情况。 m = V/E = q/6πrη （5） 由上式可以看出，迁移率仅与球形颗粒所带电荷数 量，颗粒大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。 影响电泳的因素 颗粒性质：电荷、直径、形状 电场强度 溶液性质：pH、离子强度、溶液黏度 电渗 焦耳热 筛孔 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE） 支持介质：聚丙烯酰胺凝胶 单体：丙烯酰胺单体（acrylamide，Acr） 双体，交联剂：N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，Bis） 催化剂作用下聚合为凝胶 分为连续系统与不连续系统两大类。 丙烯酰胺和N,N’-甲叉双丙烯酰胺结构式 (1) 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2) 化学性能稳定； (3) 对pH和温度变化较稳定； (4) 几乎无吸附和电渗作用； (5) 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6) 凝胶孔径可调节； (7) 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） PAGE的基本原理 不连续垂直柱状凝胶电泳 不连续垂直板状电泳 线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳 连续的盘状凝胶电泳和垂直板状电泳 半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳 双向电泳 PAGE的基本原理 聚丙烯酰胺凝胶合成 丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定 丙烯酰胺的聚合 分离效应 凝胶总浓度（T）： Acr和Bis在凝胶中的总浓度。 交联度（C）： Bis占总浓度的百分含量 T与C的关系 一般而言，C随T的增加而降低 T一定时，C为5%时，凝胶孔径最小。因此目前有些实验室采用a:b=19:1 a:b10，凝胶变硬成乳白色；a:b100，凝胶呈糊状，易断裂。 凝胶总浓度(T)和交联度(C)与孔径大小的关系 凝胶孔径大小主要受凝胶总浓度(T)的影响。 凝胶浓度越大，孔径越小。凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断。浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂。 当凝胶浓度确定后，交联度为5%时，凝胶具有最小孔径，超过5%或低于5%时凝胶孔径都要增大 凝胶浓度的选择 标准胶：在总浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。 对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。 PAGE的基本原理 聚丙烯酰胺凝胶合成 丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定 丙烯酰胺的聚合 分离效应 丙烯酰胺的聚合 化学催化系统： 是在引发剂和加速剂组成的系统中完成的。有碱性系统和酸性系统 光催化系统 化学催化——碱性系统 化学催化——酸性系统 引发剂：核黄素 加速剂：TEMED可以加速聚合 核黄素经光照后再被痕量氧氧产生自由基，引发聚合反应。 化学聚合与光聚合的比较 化学聚合的凝胶孔径小，透明度好，重复性也较好，但AP可能影响蛋白质活性。 光聚合的凝胶对分析样品无任何不良影响，但凝胶呈乳白色，透明度较