第六章外源基因的表达1资料.ppt

第六章 外源基因的表达 最佳的基因表达体系： 目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。 1 基因表达的机制 1.1 外源基因的起始转录 1.2 mRNA的延伸和稳定性 1.3 外源基因mRNA的有效翻译 1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性 1.5 目的基因沉默 mRNA的稳定性直接决定翻译产物的多少。 对原核细胞来说，最佳的方法是选择一个RNase缺失的受体菌。 真核细胞来说，则需要考虑增加mRNA的正确加工，提高成熟mRNA的稳定性。 1 基因表达的机制 1.1 外源基因的起始转录 1.2 mRNA的延伸和稳定性 1.3 外源基因mRNA的有效翻译 1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性 1.5 目的基因沉默 1 基因表达的机制 1.1 外源基因的起始转录 1.2 mRNA的延伸和稳定性 1.3 外源基因mRNA的有效翻译 1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性 1.5 目的基因沉默 1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性 外源基因的表达产物能否在宿主细胞中稳定积累而不被内源蛋白水解酶所水解是基因有效表达的一个重要因素。 （1）构建融合蛋白表达系统。 （2） 构建分泌蛋白表达系统。 （3）构建包涵体表达系统。 （4）选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统。 1 基因表达的机制 1.1 外源基因的起始转录 1.2 mRNA的延伸和稳定性 1.3 外源基mRNA的有效翻译 1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性 1.5 目的基因沉默 共抑制（cosuppression）是转录后水平的基因沉默的一种，指被整合的外源基因沉默的同时，与其同源的内源DNA的表达也受到抑制。 2 基因表达的调控元件 2.1 启动子 2.2 增强子 2.3 终止子 2.4 衰减子 2.5 绝缘子 2.6 反义子 2 基因表达的调控元件 2.1 启动子 2.2 增强子 2.3 终止子 2.4 衰减子 2.5 绝缘子 2.6 反义子 2 基因表达的调控元件 2.1 启动子 2.2 增强子 2.3 终止子 2.4 衰减子 2.5 绝缘子 2.6 反义子 翻译终止密码子 3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式 （1）包涵体型异源蛋白 （2）融合蛋白 （3） 分泌蛋白 （4）寡聚型外源蛋白 （5）整合型外源蛋白 3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式 A）包涵体型异源蛋白 包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在细胞中累积，致密地积聚在细胞内或被膜包裹或形成无膜裸露的结构。 结构特点：具有正确的氨基酸序列，但空间结构是错误的，无生物学活性。 优点：简化了外源基因表达产物的分离纯化程序。 B）融合型异源蛋白 融合蛋白：外源蛋白基因和受体菌自身蛋白基因重组在一起，不改变两个基因阅读框。 受体菌蛋白位于N端，外源蛋白在C端。 特点：受体菌蛋白与异源蛋白形成良好的杂合构象，使得多肽链上的蛋白酶切位点隐藏在蛋白分子内部而不易被切割，因而大大增加了产物的稳定性。 C）寡聚型异源蛋白 在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串连在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋白。 D）整合型异源蛋白 将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表达的外源蛋白即为整合型外源蛋白。 外源基因与宿主染色体整合是根据DNA同源交换的原理 E）分泌型蛋白 将分泌型蛋白的信号肽编码序列与外源基因拼接，使异源蛋白表达后分泌到细胞周质中或直接进入到培养基中。 优点：增大表达蛋白的稳定性，简化后续的分离纯化步骤 3.1.5 外源基因的高效表达策略 优化表达载体：高效启动子 提高稀有密码子tRNA的表达 提高mRNA稳定性 提高外源基因表达产物的稳定性 优化发酵过程 4.1.1 外源基因转录产物的检测－Northern杂交 4.1.2 报告基因的酶法检测： β-葡萄糖苷酸酶基因（gus基因）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat基因）、冠瘿碱合成酶基因、抗卡那霉素基因（npt-Ⅱ基因）等。 4.1.3 免疫学检测 免疫沉淀法 酶联免疫吸附法 Western印迹法 固相放射免疫法 4.1.4 表达产物生物学活性检测 基因工程应用 生物学将成为21世纪最主要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一，基因工程产品的产值将占GDP的25%以上。 基因工程研究和应用范围非常广泛，它涉及工业、农业、环境、能源和医