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紫外可见分光光度计的使用 紫外可见分光光度计的使用 分光光度计的结构类型:单光束分光光度计和双光束分光光度计 不同相态样品的分析 比色皿的使用常识 吸光度读数范围 吸收波长的选择 参比溶液的选择 狭缝大小的选择 重复测定次数和波长扫描速度 测定波长间隔 标准曲线法和标准加入法 时间扫描功能 分光光度计的结构 分光光度计 分光光度计光路 双光束分光光度计 分光光度计 不同相态样品的分析 通常的紫外可见分光光度计只能进行溶液样品的分析。 配以合适的样品架，可以测量气体，也可以对透明的薄片（如滤光片）或薄膜状材料进行定性分析。 固体粉末样品由于通常透光性质不好，需要配成溶液或用积分球附近进行漫反射谱测量。 积分球与固体漫反射谱 获得固体漫反射谱，可以间接反映固体样品的吸收 内壁材料：BaSO4，聚四氟乙烯 适宜于测量粉末样品 样品可压片或与BaSO4混合后压片制样 吸收池及使用常识 分光光度法中的吸收池又称比色皿，可见分光光度法中使用的比色皿用光学玻璃制造，可用于大于350nm的波长范围。 常用的比色皿有0.5－10cm各种光程，可根据需要选用 拿持比色皿时不能接触抛光面 定量分析时比色面必须配对使用 吸光度读数范围 吸光度测量误差在透过率过大或过小时都会变大，为了满足定量分析的误差要求(通常为5%),在定量分析时要求吸光度应在一定的范围内 吸光度读数范围的具体值与仪器性能有关，主要是与仪器检测系统噪声大小及光学系统杂散光的大小有关，通常都在0.1-1.0范围内，低档次的仪器通常可用范围比高档次仪器要小。 吸光度读数范围 根据朗伯比尔定律，A＝?bc, 影响吸光度大小的因素主要是样品摩尔吸光系数，浓度和比色皿光程。 实验中吸光度过大的样品可通过稀释样品使吸光度到所需范围内。 如果样品不能稀释，可以改用光程较小的比色皿减小吸光度。 吸光度过小的样品可使用光程较大的比色皿以增大吸光度。 吸收波长的选择 进行单波长测量时，需要考虑朗伯比尔定律对入射光单色性的要求和测定灵敏度的要求。 没有干扰时，一般选择在吸收峰的最大吸收波长位置处，如果有干扰，选择在没有干扰且吸光度变化较平缓的位置。 进行多波长校正时，除尽量满足单波长测定的波长要求外，还要求多个组分间的吸收光谱间线性无关。 参比溶液的选择 使用参比溶液是为了校正除待测组分外所有其他因素所引起的透射光强度的减弱。所以最佳的参比样品是待测样品中只除去待测组分后的剩余部分。 常用的参比溶液有纯溶剂，空白溶液（不加试样溶液，含显色剂等），加了掩蔽剂的试样溶液 混合溶液中待测组分吸光度的测量 适用于混合溶液中任一单一组分 吸光度的加和性，混合溶液 A总=A待测+A共存 也就是 A待测= A总 - A共存 若 A参比 = A共存 =0，则 A待测= A总 参比溶液与吸光度的测定 待测溶液的制备 原始待测溶液(含有Fe2+及其它共存组分) 加入过量显色剂，根据需要加入其它试剂(可能包括缓冲试剂，离子强度调节剂等)，这部分总称为试剂 加入溶剂稀释到适宜体积 待测溶液的成分 待测离子Fe2+ [Fe(phen)3] 其它共存组分 过量的phen 其它加入的试剂(可能包括缓冲试剂，离子强度调节剂等) 如何选择参比溶液 总的原则：使试液的吸光度能准确反映待测组分的吸收（在测定波长处有吸收的部分在参比溶液中应保留） 理想的参比溶液是：试液中去除待测组分，保留其他所有组分的溶液 狭缝的选择 狭缝的大小会影响到仪器的信噪比和标准曲线的线性范围。 狭缝过大，通常会使线性范围变小，特别是当不在最大吸收波长位置测定时更是如此。 狭缝过小，造成入射光能量过小，信噪比变差，基线平直度和测量数据的重复性会变差。 此外，还需要考虑样品吸收峰宽度的影响。通常单波长测定时，一般选择在最大吸收波长位置，线性范围容易满足，可选择较宽的狭缝（1-2nm）多波长测定时，很难同时在所有波长都满足线性范围要求，应选择较小的狭缝。 标准曲线法和标准加入法 无法或不易得到与样品相近的基体时用标准加入法 同类样品数量较多时用标准曲线法 只有一两个样品时可以用标准对照法 重复测定次数和波长扫描速度 对吸光度不是很大的样品，或者狭缝不是很小，这时检测器检测的光信号的强度是比较大的，重复性较好，可选择较少的重复次数。相反，如果样品吸光度很大，狭缝很小，选择较大的重复次数可获得更好的结果。 一般可以用快速扫描，当信噪比较差，谱峰窄且多时用慢速扫描。 测定波长间隔 在扫描光谱时需要选择，可根据样品吸收峰的宽度进行选择，峰宽较大时，可选择较大的波长间隔。反之亦反。通常每个正常的吸收峰应该用不少于30个数据点表示出来。 * * 光源 单色器 样品池 检测器 显示装置