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用取代型（a）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验 正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞 （1）利用同源重组进行基因敲除 （2）利用随机插入突变进行基因敲除 （3） RNA干扰引起的基因敲除 2、几种常用的基因敲除技术 基因敲除是在同源重组技术及胚胎干细胞技术的基础上逐步完善发展起来。 主要利用DNA转化技术,将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞,通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组,将外源基因整合入内源基因组内,使外源基因得以表达。 通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变,达到研究基因功能的目的。 目前较为有效的方法是大规模的随机插入突变,它为在基因组范围内敲除掉任何一个基因提供了可能。这项技术具有效率高、基因完全失活、容易分离鉴定被插入引起失活的目的基因等优点。 随机插入突变可以分为： （1）T-DNA插入突变 （2）转座子插入突变 该技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。 利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失 活”。 T-DNA插入突变 a. 引物设计。LP和RP分别代表插入基因两端的引物，LB是指载体上的一段 引物，目的基因片段(设为900bp)。旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。 b. PCR产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和纯合子PCR条带。 植物基因敲除 及突变体筛选 它是利用转座子在染色体上可移动的特点，当它跳跃插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型。 因此可以利用某些能随机插入基因序列的转座子，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。 转座子插入突变 现在普遍认为转录后基因沉默是生物保持基因的完整性,抵御外来核酸入侵,抑制转座因子诱导DNA突变的手段,广泛存在于真菌、植物、线虫、脊椎动物和大肠杆菌中。 RNA干扰(RNAi)是一种普遍的转录后基因沉默的机制。 RNA干扰：由siRNA引起,siRNA是外源基因产生的dsRNA在Dicer酶的作用下所产生的长度为21-22nt的一系列片段的总称,具有很强的关闭基因的功能,能够介导RNA干涉现象,诱导出一种siRNA分子、核酸酶以及螺旋酶等结合在一起的RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。 RISC能够解开siRNA并精确的指导特异mRNA降解,使细胞抵抗外来基因侵入及病毒感染。 因此,通过将dsRNA分子导入细胞内,特异性地降解细胞内与其同源的mRNA,封闭内源性基因的表达来失活该基因同样可以实现基因的敲除。 1、定义 分子定向进化：是在分子水平研究所需生物的特定基因或蛋白质，可以在试管里进行无性繁殖或有性繁殖，其实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用，是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化机制，使进化朝着人们需要的方向发展。 2.原理 在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA多聚酶不具有3’ 一5 ‘校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体 。分子定向进化其实是突变加筛选／选择的重复循环，且整个进化过程完全是在人为控制下进行的。 1.致错PCR(epPCR)技术是指在利用Taq酶进行PCR扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变。 2. .盒式突变技术 即寡核苷酸介导的诱变技术，是用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代野生型基因中的相应序列。 3. DNA改组技术，又称有性PCR(sexualPCR)或分子育种(molecular breeding)，即DNA分子的体外重组。通过DNA shufling技术，既可对单基因或DNA片段进行改组，也可对基因组或染色体等进行改组 。 4.高通量筛选技术/表面展示技术是筛选蛋白质突变体库的高通量筛选方法，特别在抗体的研究当中应用非常普遍，具有高效、高灵敏度等特点。目前，表面展示技术有：噬菌体表面展示技术，细菌表面展示技术，酵母表面展示技术，酵母双杂交系统，核糖体展示技术．蛋白质片断互补试验. （1）.噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高通量筛选的方法。人们利用这一技术可以将各种自然界或人工合成的DNA整合到丝状噬菌体基因中，以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面，利用噬菌体展示库所固有的基因型和表现型之间的直接关联进行检测。如抗原抗体反应，生物素结合