细胞培养技术进阶教程精要.pptVIP

培养液中盐浓度不正确 在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液 细菌、酵母或真菌污染 丢弃培养物或用抗生素除菌 8、培养液出现沉淀，但pH值不变 用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来 用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌 冰冻保存培养液 将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液 9、培养液出现沉淀，同时pH 发生变化 细菌或真菌污染 丢弃培养物 抗生素除菌 10、原代细胞培养物污染 原代培养组织在进入培养前已污染 培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织 11、支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？ 不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。 如有支原体污染，直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 * 由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果 * 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液 * 死细胞的细胞膜通透性发生改变，染料可大量进入却不能被排出，因而细胞被染色；而活细胞能排出细胞内的染料，因而不易着色。 0.4%台盼兰染液配制： 台盼兰 0.4克 加双蒸水至100 ml. * 一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。 * 由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常 正常细胞的G1/ G0 期具有二倍体细胞的DNA 含量(2N) ,而 G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S 期的DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。因此,通过流式细胞术PI 染色法对细胞内DNA 含量进行检测时,可以将细胞周期各 时相区分为G1/ G0 期,S 期和G2/ M 期,并可通过特殊软件 计算各时相的百分率。值得注意的是, PI 不能通过细胞膜 完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞) ,在标本制备时,必 须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性,才能使PI 进入细胞内与细胞内的核酸结合。乙醇通常为终浓度为 70 %的冷乙醇。 * * 是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 * 不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。 * 前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞 前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞 * 在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI- 6、细胞周期检测 流式细胞术PI染色 细胞周期:细胞每一次分裂增殖的周期 流式细胞术PI染色检测细胞周期 原理：碘化丙锭（PI）可与细胞内DNA 和RNA 结合,采用RNA 酶将RNA 消化后,通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。 通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA 含量进行检测时,可以区分细胞周期各时相： G1/ G0 期具有二倍体细胞的DNA 含量 G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) S 期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间 应用：通过流式细胞仪分析各时期的细胞百分数，可检测细胞的增殖周期。 增加膜通透性 消化RNA 7、细胞凋亡的检测 凋亡形态学特征 ●细胞体积变小，胞质浓缩。 ●胞膜结构完整，有泡状突起。 ●核染色质浓缩，聚集核膜周围。 ●细胞膜内陷形成凋亡小体 (Apoptotic bodies)。 ●无内容物外溢，因而不引起周围的炎症反应。