微生物非培养技术的未知种群检测与功能解析.pptVIP

市政环境工程学院 环境科学与工程系 马放 马放 主要内容 传统环境微生物分析方法面临的挑战 现代环境微生物分析方法发展概述 rDNA序列同源性微生物鉴定及其种群组成分析中的应用 PCR扩增技术的应用 核酸探针杂交技术的应用 DNA指纹图谱技术 传统环境微生物分析方法面临的挑战 利用传统的微生物纯培养技术获得单一的微生物包括纯种分离和培养两个过程。纯种分离的方法很多，可归纳为两大类：一类是单细胞或单孢子分离；一类是单菌落分离。 传统环境微生物分析方法面临的挑战 微生物与农业 微生物与工业 微生物与医学 微生物与环境保护 微生物与能源开发 传统环境微生物分析方法面临的挑战 在分子生物学诞生的20多年时间里，人们运用基因工程的几大基本技术：凝胶电泳技术、核酸分子杂交技术、细菌转化技术、DNA序列分析技术及基因定点突变技术，对食品、医学、农业及环境保护等各个领域的应用微生物进行基因改造，实现了人为改造或修饰生物遗传特性并创造生物新性状的梦想。 传统环境微生物分析方法面临的挑战 传统环境微生物分析方法面临的挑战 传统环境微生物分析方法面临的挑战 纯培养技术使得研究者摆脱了多种微生物共存的复杂局面，从而能够不受干扰地对单一菌落进行研究，确保了人类对微生物形态结构、生理和遗传特性的认识。但是，随着研究的不断进行，这一技术暴露出巨大的局限性——平板计数异常 (Plate Countanomaly)，即环境中微生物实际数量同平板菌落计数之间存在巨大差异。 传统环境微生物分析方法面临的挑战 造成平板计数异常的原因： 由于实验室难以再现微生物的自然生存条件 大种群微生物易形成优势种进而抑制了小种群的生长 传统环境微生物分析方法面临的挑战 微生物的自然多样性 结构多样性 代谢多样性 行为多样性 进化多样性 生态多样性 传统环境微生物分析方法面临的挑战 现代环境微生物分析方法发展概述 微生物非培养技术的产生与发展 现代环境微生物分析方法发展概述 现代环境微生物分析方法发展概述 现代环境微生物分析方法发展概述 现代环境微生物分析方法发展概述 现代环境微生物分析方法发展概述 rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析 研究DNA多态性的最直接、有效的途径就是测定DNA的序列，但测序是一项极为复杂和艰难的工作，同时也需要昂贵的设备。目前，在针对微生物研究的DNA指纹技术中，最常见的靶基因是16S rDNA和核糖体DNA的基因间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)。 rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析 细菌的23S rDNA、16S rDNA和5S rDNA分别含有约为2900个、1540个和120个呈现不同碱基对排列的核苷酸。 rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析 rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析 rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析 1980年，Brosius等利用23S rRNA基因序列测定的方法推导出大肠杆菌23S rRNA的全部核苷酸排列顺序，整个分子含有2904个核苷酸。1981年相继有三个实验室提出了大肠杆菌23S rRNA的二级结构模型。目前已经获得了大量有关23S rRNA基因序列的信息，不同来源的23S rRNA约有60%~70%的结构共同性。大肠杆菌23S rRNA的一级结构与酵母也有很大相似性。虽然已有大量的大肠杆菌23S rRNA基因序列信息，但是相比于16S rRNA基因序列信息要少得多，因此在微生物分析中还没有得到广泛的应用。 rDNA序列的微生物鉴定及种群组成分析 PCR扩增技术的应用 不同种类的PCR方法 反向PCR技术 定量PCR技术 定量PCR技术 反转录PCR技术 热不对称交错PCR技术 核酸探针杂交技术的应用 菌落原位杂交 Southern印迹 荧光原位杂交技术 荧光原位杂交技术 荧光原位杂交技术 荧光原位杂交技术 生物芯片技术 生物芯片技术 生物芯片技术 生物芯片技术 生物芯片技术 DNA指纹图谱技术 DNA指纹图谱技术 DNA指纹图谱技术 DNA指纹图谱技术 DNA指纹图谱技术 DNA指纹图谱技术 DNA指纹图谱技术 DNA指纹图谱技术 DNA指纹图谱技术 DNA指纹图谱技术 DNA指纹图谱技术 DNA指纹图谱技术 DNA指纹图谱技术 反向PCR的原理示意图 常规PCR是扩增两引物之间的DNA片段，反向PCR（reverse PCR）是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段。 原位PCR技术 原位PCR可应用于多种类型的研究材料（组织切片、离心细胞、悬浮细胞等）不同拷贝数目的序列（病毒的或基因组的DNA或