凋亡实验Qiu资料.ppt

方 法 设空白组、正常对照组、加药实验组 （1）细胞传代∶将贴壁生长的肝癌细胞用0.25%胰酶消化终止后，调整细胞密度为5×104个/ml,每孔100μl传于96孔板A、B、C、D四个排孔内，待细胞培养至指数生长期时加药。 （2）每孔加入不同剂量的大蒜素（1、5、10 ml），每种剂量加三孔，以药物溶剂作对照，将培养板放回37℃继续培养0.5h； 1ul 10ul 1ul 5ul 10ul 第1组 2 3 4 5 6 7 8 5ul 10ul 10ul 大蒜素 剂量 对照组 方 法 （3）于各孔加入10ml 5mg/ml MTT， 37℃培养3-4h；（细胞在SDH作用下把黄色MTT还原成紫兰色结晶）。 （4）吸弃培养液，各孔加入100μlDMSO，将培养板振荡10～20分钟，37℃培养10min 。 （5）用酶联仪测定光密度值（以空白调零），通过与对照组比较得到实验组的存活率。 结 果 （1）加MTT4小时后，倒置相差显微镜下观察可见黄色的MTT被还原成紫蓝色颗粒，加DMSO后紫蓝色颗粒溶解。 （2）各组OD值取平均值后，以下式计算存活细胞百分数∶ OD实验组 存活细胞%= ×100% OD对照组 （以空白组OD值调零） 对照组 1ul 10ul 5ul 实验组 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 实验内容 培养细胞的凋亡诱导及形态学观察 MTT法检查培养细胞增殖活力 邱 春 红 医学院细胞生物学研究所 2013年11月 ◆凋亡诱导： 肝癌细胞HepG2 （1）培养液：10%小牛血清 RPMI 1640 培养条件：37℃ 5%二氧化碳饱和湿度培养箱 （2）传代：以5×104细胞密度于含有盖玻片的24孔板， 37℃培养过夜； （3）每孔加入5ml的大蒜素（终浓度为60μg/ml），以药物溶剂（PBS）作对照，37 ℃培养0.5~1h； 5人分组、加药 每组3个孔加药，一个对照（PBS） A B C D 1 2 3 4 5 6 1组 5组 2组 6组 3组 7组 4组 8组 对照 2 10 20 对照 2 10 20 对照 2 10 20 对照 2 10 20 诱导细胞凋亡的因子 ◆物理性因子：包括射线（紫外线，? 射线等）， 较温和的温度刺激（如热激，冷激）等 ◆化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA 和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿 瘤坏死因子?（TNF?），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等 细胞凋亡研究方法 诱导细胞凋亡 检 测 形态学特征 生物化学特征 显微结构 超微结构 （DNA含量及降解分析） 琼脂糖电泳法 流式细胞检测法 （药物、紫外线等） 一、细胞凋亡的形态学特征 ◆凋亡形态学检测： 1、凋亡起始 2、凋亡小体形成 3、凋亡小体被吞噬、消化 （1）凋亡起始 微绒毛消失，线粒体正常， 染色质固缩、边集 染色质固缩、边集 微绒毛消失 （2）凋亡小体形成 染色质片段化与细胞器一起被反折的膜包围， 出芽形成凋亡小体。 Macrophage/Phagocyte (3) 凋亡小体被吞噬、消化 二、实验操作方法与步骤 1.凋亡诱导： 2. 显微镜观察 观察细胞形态特征，如细胞缩小，核质固缩聚集，形成嗜酸小体及吞噬现象等。但一般只能作为细胞凋亡的推测，不具有