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不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白 （实验报告） 实验日期：2015年4月14日 实验温度：室温 实验地点：生物化学与遗传学实验室 指导老师：*** 班级：2013级生物技术1班 姓名：****** 学号：******* I. 实验目的 1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理； 2.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术； 3.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用。 II. 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统（即缓冲液成分、pH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。 ※聚丙烯酰胺凝胶（PAG）的聚合反应： 由单体聚丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的三维网状结构凝胶。 Bis：交联剂 过硫酸铵(AP) ：引发剂，提供自由基，引发聚合反应 四甲基乙二胺(TEMED)：催化剂, 加快引发释放自由基的速度 分离机制： 1.浓缩效应 ·凝胶层孔径不连续：浓缩胶大孔径，分离胶小孔径； ·pH值不连续：电泳缓冲液pH=8.3；浓缩胶pH=6.7；分离胶pH=8.9； ·缓冲液离子不连续：电泳液中Gly-(慢离子)；凝胶中 Cl-（快离子）；Pr-介于二者之间； ·电位梯度不连续 成分 PH值 孔径 电泳缓冲液 甘氨酸慢离子 8.3 样品 蛋白质 6.7 浓缩胶 Cl-（快离子） 6.8 小 分离胶 Cl-（快离子） 8.8 大 电泳时，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。 2.分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一 定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同 的迁移率。 3.电荷效应 电荷量不同，迁移率不同。 III. 实验试剂与仪器 1.实验试剂 ①1.5mol/L Tris-HCl PH 8.8；②30%丙烯酰胺单体储液；③10%过硫酸铵；④TEMED；⑤0.5mol/L Tris-HCl PH 6.8；⑥Tris-甘氨酸 电泳缓冲液 PH8.3；⑦考马斯亮蓝G-250；⑧上样缓冲液；⑨脱色液。 2.实验器材 玻璃板，梳子，夹子，电泳仪，加热器，电泳槽。 IV. 实验操作步骤 1. 安装垂直板灌胶模具； 2. 按照配方配置10mL分离胶溶液（2.5毫升 1号夜；2.5毫升 2号夜；H2O 5毫升；80微升 3号夜；8微升 4号夜）（备注：加入TEMED后立即灌胶） 3. 分离胶溶液充分混匀后从一侧加入灌胶模具，上方留约2.5～3.040～605mL浓缩胶溶液（0.66毫升 2号夜；0.5毫升 5号夜；H2O 3毫升；100微升 3号夜；8微升 4号夜），摇匀； 6. 灌制浓缩胶，并插入与模具大小相同，凝胶厚度相当的梳子～9. 制备好的蛋白质样品用上样缓冲液按2:1（样品2份上样缓冲液1份）混合，上样； 10. 连接电源，5～10mA20～30mA0.5～1.0cm V. 实验结果分析 观察结果，描出血清电泳区带图谱，分析有无异常。 VI. 注意事项 1．TEMED的量应根据室温和聚合情况而定。 2．4℃放置12小时后再使用，以使凝胶充分聚合，改善电泳时的分辨率。 3．4．5．6． - 1 -