藻酸钙凝胶复合种异体胚胎骨膜细胞悬液移植修复骨缺损的实验研究.pdf

中文摘要 藻酸钙凝胶复合同种异体胚胎骨膜细胞悬液移植修 复骨缺损的实验研究 摘 要 目的：由于各种原因所致的骨骼缺损是相关临床科室面 临的棘手问题，植骨术是解决这一问题的主要方法。植骨术 又大致分为自体来源植骨术、同种异体或异种植骨术以及当 今研究比较热门的组织工程骨植骨术。前两种方法的弊端或 局限性包括供源不足，导致供区损伤和并发症、移植免疫反 应等。而利用组织工程学原理和方法构建的组织工程骨移植 可克服这些不足和弊端，为骨缺损的修复提供了全新的思路 和方法。组织工程是应用细胞生物学和工程学的原理，研究 开发修复和改善损伤组织形态和功能生物替代物的一门科 学，骨组织工程包含三个关键因素：信号分子(骨生长因子、 骨诱导因子)、支架材料、靶细胞。藻酸钙凝胶是一种理想的 组织工程支架材料，目前其在骨科创伤修复方面的应用是组 织工程学的研究热点。其作为支架材料具有以下特点：(1) 具有良好的生物相容性；(2)具有良好的生物降解性或生物吸 收性；(3)支架材料的降解速率应与骨形成能力相匹配；(4) 具有良好的多孔性能；(5)具有很强的渗透能力。藻酸钙凝胶 在组织工程骨(软骨)、药物缓释系统和细胞三维培养等多 方面得到了广泛应用。骨膜分为纤维层和生发层，生发层有 成骨能力故又称成骨层，其细胞成分有骨祖细胞、成骨细胞、 破骨细胞和血管内皮细胞。在胚胎期和出生后的成长期内生 发层由数层细胞组成其外层为成纤维细胞样骨祖细胞，内层 中文摘要 为成骨细胞，二者皆有增殖能力，且有较强的成骨能力。胚 胎骨膜免疫排斥反应很轻微，自身成骨作用强，是比较好的 种子细胞提供物。本实验将经过二步冷冻法的胚胎骨膜制备 成细胞悬液，均匀混于藻酸钙凝胶中，充分发挥了骨传导、 自身成骨及骨诱导三方面作用，用来修复骨缺损。本实验是 在总结前人研究经验的基础上，观察藻酸钙凝胶复合同种异 体胚胎骨膜细胞悬液在自体环境中能否成骨，以及成骨的方 式，从而寻找一种治疗骨缺损的便于临床应用的新方法。 方法：选用孕26,--28天孕兔10只，剖腹取胎兔，将胎 兔颅骨骨膜锐性剥离，分装入含PBS、DMEM与二甲基亚砜 混合液的冻存管中，经过二步冷冻法在．198℃的液氮中保存 24小时。37℃水浴快速复温，将胎兔骨膜制成细胞悬液。选 用成年新西兰白兔80只，随机分为四组，每组20只，所有 动物左侧桡骨造l5mm标准骨缺损后，A组植入藻酸钙凝胶 ／胚胎骨膜细胞悬液；B组植入藻酸钙凝胶；C组植入胚胎骨 膜细胞悬液；D组为空白对照。术后在2、4、6、8、12周 分别取材，每次每组动物处死4只，将标本仔细去除肌肉后 进行大体观察、X-线检查、组织学观察、同时测定血清碱性 磷酸酶、血清钙水平。从宏观和微观两方面观察骨形成情况， 并进行评分以及统计分析。 结果：术后2、4、6、8、12周进行大体观察、组织学 观察、x．线影像学及血清生化检查。结果表明：A组，移植 区域存在明显的成骨，有连续骨痴通过缺损处，骨塑型良好， 新骨增生明显，主要以多中心软骨成骨方式出现，髓腔逐渐 再通，骨重建顺利，骨缺损完全修复。无急性免疫排斥反应 表现。B组，移植区在两断端有部分骨形成，中间部分无骨 中文摘要 连结，为结缔组织占据。C组，大部分标本表现出贴近尺骨 处成骨，亦能形成连接，其余移植区被结缔组织占据，新骨 生长、骨重建少而且缓慢，其余标本无成骨，移植区完全被 结缔组织占据。亦无免疫排斥反应表现。D组全部标本在两 断端骨质硬化、髓腔闭死，中间无骨连接，结缔组织填塞。 组织学观察显示：A组，藻酸钙凝胶未降解之前，成骨过程 迅速，主要是向成软骨方向，并建立起细胞支架，4周后， 藻酸钙凝胶逐渐降解，同时软骨逐渐成骨，8周时，基本完 成骨缺损修复，新生小血管增生明显，骨小梁排列有序，成 熟骨组织替代完全，与断端无明显分界；早期植入物交界处 有弥散的淋巴细胞浸润，偶可见嗜酸粒细胞，6周时消失；B 组，藻酸钙凝胶未降解之前，有部分爬行替代过程，两断端 向中间成骨，4周后，藻酸钙凝胶逐渐降解，该过程停止， 中间缺损区存在大量结缔组织；C组，骨膜细胞附着于尺骨 骨膜生长，尺骨骨膜亦增厚，有部分小血管向移植区生长， 但移植区大部分充填了结缔组织，骨生长受挤压，形成骨量