离子交换层析纯化及丙酮沉淀.pptVIP

离子交换层析简介 概念： 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时，其结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。  离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。 操作要点 1.离子交换剂的前处理 离子交换剂使用前一般要进行再生和转型处理。首先将干粉在水中充分溶胀，用水悬浮去除杂质和细小颗粒。再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至中性，这是为了进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子。市售的离子交换剂中通常阳离子交换剂为Na型，阴离子交换剂为Cl型。处理时一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理。常用的酸是HCl，碱是NaOH或再加一定的NaCl，这样处理后阳离子交换剂为Na型，阴离子交换剂为Cl型。使用的酸碱浓度一般小于0.5 mol / L，浸泡时间一般30 min。这就是离子交换剂的再生过程。使用过的离子交换剂通过再生处理，可以使其恢复原来性状，反复使用。 离子交换剂的转型是指离子交换剂由一种平衡离子转为另一种平衡离子的过程。在离子交换层析前要注意使离子交换剂带上合适的平衡离子，使平衡离子能与样品中的组分离子进行有效的交换。在分离蛋白质时，一般不能使用H或OH型离子交换剂，因为分离过程中H或OH离子被置换出来都会改变层析柱内pH值，影响分离效果，甚至引起蛋白质的变性。本实验使用的DEAE(二乙氨乙基)-纤维素，在酸碱处理再生后，用0.02mol/L，pH6.5磷酸盐缓冲溶液浸泡即可转型。以HPO4取代DEAE中的OH—。 鸡卵粘蛋白的离子交换层析纯化 CHOM的分子是由4个亚基组成的，其等电点在pH3.9—4.5之间，分子量为2.8 ×104。在PH6.5的缓冲液中带负电荷，能被弱阴性离子交换剂DEAE纤维素吸附。由于吸附力较弱，通过提高洗脱液中盐离子的强度，可以将CHOM洗脱下来，由此达到纯化目的。 主要仪器 恒流泵 紫外检测仪 N2000生化工作站软件 布氏漏斗、抽滤瓶 循环水真空泵 ?10×200mm 层析柱 材料 DEAE-52离子交换纤维素 样品 凝胶过滤层析脱盐液 试剂 离子交换剂再生： 0.5mol/L HCl 0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 平衡液： 0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液 洗脱液： 0.3mol/L NaCl—0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液 装 柱 检测仪器的准备 打开紫外检测仪预热。按照“N 2000 生化工作站使用方法”及“核酸蛋白检测仪使用方法”连接导线、设置参数，调整好仪器。点击“基线查看”观察基线，基线平稳后即可上样。 加 样 关闭恒流泵，关紧止水夹，小心地吸去柱上多余的液体，凝胶床面上留下薄薄的一层液体即可。 用滴管将已经脱盐的CHOM粗提取液上柱吸附。待样品全部进入固定相后，加入0.02mol/L，PH6.5磷酸缓冲液并点击软件的“数据采集”。 洗 脱 中性和酸性杂蛋白不被吸附，随平衡液流出，在洗脱曲线上绘出杂蛋白峰。继续以平衡液流经柱子，当杂蛋白峰完全下降，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线后，改用含0.3mol/L NaCl的0.02mol/L，PH6.5磷酸洗脱液洗脱。鸡卵粘蛋白在DEAE—纤维素离子交换柱层析上分离图如下： 洗脱峰收集 收集第Ⅲ洗脱峰。收集的体积一般在25-30ml为宜。如果在前面的提取过程中，条件控制得适宜，提取的鸡卵粘蛋白是较纯的，有可能不出现卵清蛋白峰（峰II）。 鸡卵粘蛋白纯品的制备 丙酮沉淀