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第九章 生物芯片 biochip 何为生物芯片？ 生物芯片是通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白、核酸以及其他生物组分的准确、快捷、大信息量的检测。 生物芯片包括 生物芯片的分类 根据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。 生物芯片分析过程 内容提要 第一节 基因芯片 第二节 蛋白质芯片 第三节 芯片实验室 基因芯片技术的概念 基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。基因芯片又称DNA芯片。 DNA芯片的主要类型 按制备方式分： 原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸(ONA)而制备的芯片。合成的序列较短 cDNA微集阵列：将通过mRNA制备的（cDNA) 片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片(CDA)。固定基因的来源较灵活 一、基本原理 基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法（southern?、northern）相似。 核酸印迹：将待测样品DNA（靶基因）固定于支持物上，用已知序列DNA片段制作探针，二者按碱基互补配对原理杂交，检测出欲鉴定的基因。 基因芯片：将大量已知基因片段（与核酸印迹相反）以微阵列方式固定在支持物上，待测样品用荧光染料标记制成探针，当探针与芯片上的靶基因杂交后，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。 基因芯片在一微小的基片表面集成了大量的DNA分子，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析。 基因芯片技术流程 1.芯片制备-目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。 2.样品制备-生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。 3.杂交反应-杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的DNA片段进行的反应,产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。 4.信号检测和结果分析-杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。 基因芯片的基本要素 固相介质 有硅片、二氧化硅、玻璃、尼龙膜、塑料等。 靶片段 DNA、寡核苷酸、RNA等。 探 针 mRNA，或是以mRNA为模板合成的cDNA。 标记物 常采用荧光剂，如Cy3、Cy5， 同位素、地高辛等。 (一)芯片的制备 1.支持物的预处理（略） 2.制作DNA芯片 (1)原位合成芯片的制备 A.光引导原位聚合技术：支持物表面活性基团连接有光敏保护基团（X）受到保护。 优点： 合成效率高，点阵密度高； 缺点： 设备昂贵，技术复杂，反应产率低。 (2)DNA微集阵列的制备 方式：预先合成寡聚核苷酸、cDNA或DNA基因组通过高速点样打印到芯片上。 A.DNA片段的制备 已克隆的基因片段 PCR，RT-PCR扩增的基因片段 人工合成的DNA片段 单链、双链、DNA或RNA 均可 B. 打印 喷墨打印（非接触式点样） 优点、缺点 针式打印 （接触式点样） 优点、缺点 点阵芯片的制作技术 DNA点阵芯片 C.固化 打印DNA片段后，需要将其固定在支持物表面，同时也要封闭支持物上未打印区域以防止核酸样品的非特异性固定。 (二)测定样品的准备 1.样品的分离纯化 DNA , mRNA 2.扩增 PCR, RT—PCR，固相PCR 3.标记等过程 荧光标记（常用Cy3、Cy5），生物素,放射性标记 4.标记后样品的纯化 (三)分子杂交 样品与DNA芯片上的阵列进行杂交。 与经典分子杂交的区别： 杂交时间短，30分钟内完成； 可同时平行检测许多基因序列。 影响杂交反应的因素： 盐浓度、温度、反应时间、DNA二级结构 芯片合成程序 (四)检测分析 激光激发使含荧光标记的DNA片段发射荧光 激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的信号 软件