第七章生物信息学与分子育种资料.ppt

第三节 引物设计 引物设计的原则 ? 首先引物要跟模板紧密结合； 其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在； 最后引物不能在别的非目的位点引起高效DNA聚合反应(即错配)。 围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如： 引物长度（primer length）， 产物长度（product length）， 序列Tm值 (melting temperature)， ΔG值(internal stability)， 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）， 错误引发位点（false priming site）， 引物及产物GC含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。 引物设计需要考虑的因素 引物设计要点 1. 一般引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-21bp，过长或过短都不合适。 2. 引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。 3. 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 4. 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右，当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。 引物设计要点 5. ΔG值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个重要的引物评价指标，一般情况下，在Oligo 5.0软件的ΔG值窗口中，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间部分ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。分析其原理，引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利于引物与模板序列的整合，因此5’端与中间段的ΔG值应较高，而3’端ΔG值影响DNA聚合酶对模板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。 引物设计要点 6. 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的产物的假带。 7. 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行。 8. 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有利于以后的工作。 关于引物的自动搜索和评价分析 推荐使用自动搜索软件： Primer Premier 5.0 （实例） 推荐使用引物评价软件： Oligo 5/6 第四节 序列拼接第五节 电子克隆 具体实例（软件DNAman） 第七章 生物信息学与分子育种 第一节 数据库 第二节 序列比对与进化分析 第三节 引物设计 第四节 序列拼接 第五节 电子克隆 第一节 数据库 1 国际上权威的核酸序列数据库 （1）欧洲分子生物学实验室的EMBL http://www.embl-heidelberg.de （2）美国生物技术信息中心的GenBank /Web/Genbank/index.html （3）日本遗传研究所的DDBJ http://www.ddbj.nig.ac.jp/ GenBank DDBJ EMBL 美国的核酸数据库GenBank〖Banson,D.A. et al. (1998) Nucleic Acids Res. 26, 1-7〗从1979年开始建设，1982年正式运行； 欧洲分子生物学实验室的EMBL数据库也于1982年开始服务 日本于1984年开始建立国家级的核酸数据库DDBJ，并于1987年正式服务。 2 蛋白质序列数据库 SWISS－PROT(欧洲) PIR(美国) 3 农业数据库 作物基因组数据库 GrainGenes () 禾本科比较基因组数据库 Gramene 数据库（） 第二节 序列比对与进化分析 序列比对 (Sequence alignment)：通过比较生物分子序列，发现它们的相似性，找出序列之间共同的区域，同时辨别序列之间的差异，从而揭示生物序列的功能、结构和进化的信息。 同源 如果两条或多条序列拥有共同祖先，则称它们同源。 直系同源：不同物种间，功能相同或相似的序列来源于共同祖先的现象，称直系同源。 并系同源：同一物种中，由于基因倍增事件产生相似序列的现象。 异同源：指物种间遗传物质平行转移的现象。如：抗虫棉中的Bt基因是从芽孢杆菌转化来的，这种现象称异同源。 核苷酸和蛋白质序列