第六章电泳.pptVIP

考马斯亮蓝和银染的优缺点： 操作复杂性 检测限 考马斯亮蓝染色 银染色 2、SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS是阴离子去污剂，带大量的负电荷 SDS和蛋白结合后，抵消了蛋白所带电荷的差异，蛋白质只根据分子量大小泳动 SDS使亚基解聚 电极缓冲液、样品缓冲液都加SDS 凝胶配方 储存液 凝胶终浓度T(C=3%) 3% 5% 10% 15% 20% 丙烯酰胺储液ml 3.4 5 10 15 20 浓缩胶缓冲液 2.4 分离胶缓冲液 7.5 7.5 7.5 7.5 10%SDS 0.2 0.3 0.3 0.3 0.3 双蒸水 14 17.2 12.2 7.2 2.2 10%过硫酸铵μ l 10 10 10 10 10 TEMED μ l 10 10 10 10 10 SDS的应用 测定分子量 标准曲线制作 迁移率Rf LgM 0 迁移率Rf 计算 染料距加样端迁移距离（cm） 样品距加样端迁移距离（cm） ＝ 第三节 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由D—半乳糖和3、6—脱水—L—半乳糖结合的链状多糖。 特点： 胶孔较PAGE胶大 一般用于分离核酸 操作简便 琼脂糖凝胶电泳装置 基本操作步骤 电极缓冲液中融化琼脂糖，制备胶板 加样和电泳 （方向：负极向正极） 观察 EB染色，紫外254nm观察，凝胶成像 实验步骤 制 胶 90℃以上熔化，凝胶温度35-43 ℃ EB 1 2 3 1、孔深 2、预留尺寸 3、梳子宽度 1+2= 胶的厚度 3 - + 加缓冲液 - + 点 样 上样缓冲液：0.25溴酚蓝，025％二甲苯氰FF,40%蔗糖溶液 溴酚蓝、二甲苯氰为指示剂，溴酚蓝相当于200bp；二甲苯氰FF,40相当于6KB. - + 电 泳 紫外观察 ﹢ ﹣ 用于核酸物质分离 思考题 1、电泳的定义和原理 2、常用的区带电泳有哪些？ 3、聚丙烯酰胺凝胶电泳制胶用的单体、交联剂、催化剂、加速剂 4、聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法，优缺点 5、什么是SDS６、聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳应用 由于两种离子泳动速度不同，形成一个无离子中间层，这个区E高，高到无法以任何效应使蛋白质分离，形成一个条带。 LgM和Rf呈线性关系，随着蛋白质分子量的减小，迁移率增加。 第六章 电泳 第一节 概述 第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳 第三节 琼脂糖凝胶电泳 第一节 概述 什么是电泳？ 电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象。 带正电荷的粒子向负极移动，带负电荷的粒子向正极移动。 原理 带有电荷生物分子在电场作用下可发生移动。 由于混合物各组分所带电荷性质、数量以及分子量各不相同，在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速度也各有差异。 在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。 19世纪初(1808)发现了电泳现象。当时多用于胶体化学的分析。 1937年Tiselius利用U形玻管进行血清蛋白电泳，以界面折光率差别分离蛋白，即界面电泳。 1948年 Wieland等发明以滤纸作为支持物，使电泳技术大为简化。 近几十年来，由于采用多种新型支持物，仪器装置亦得到不断改进，因此出现了许多新型的电泳技术。 迁移率 设一带电粒子在电场中所受的力为F，则 F=QE （Q为粒子所带电荷，E为电场强度） 根据Stoke定律，一球形分子在溶液中运动所受的阻力F’为： F’=6πrηv （v为分子移动速度；r为分子半径；η为介质粘度） 当分子达到动态平衡时， F= F’ 即 QE= 6πrηv 移项得 v/E=Q/ 6πrη v/E表示单位电场强度时粒子运动速度，称为迁移率，也称电泳速度，以?表示。 因此上式也可表示为： ?=Q / 6πrη ?=Q / 6πrη 带电粒子在电场中的移动与: 粒子的电荷有关，电荷越多越快 粒子大小有关，颗粒直径越小越快 粒子的形状有关，越接近球形