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* * 蛋白质研究技术 - 蛋白质分离纯化 - 层析 - 电泳 - 氨基酸序列分析 - 肽的化学合成 §1. 蛋白质分离纯化 (separation purification) 三阶段纯化策略 (纯化所涉及的具体步骤最终要取决于样品的性质，但具有共同的可参考阶段) - 捕获阶段 初步澄清、浓缩和稳定目标/靶蛋白 - 中度纯化阶段 除去大多数杂质，包括非靶蛋白及核酸等 - 精制阶段 除去残余的痕量杂质 亲和 特异性结合 疏水 疏水性 凝胶过滤 分子量 离子交换 电荷(等电点) 方法 蛋白质的性质 可依据蛋白质的特殊性质而采用不同的分离方法 所用步骤及数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途 - 透析/超过滤法常用于去除 各种盐类和小分子杂质 (eg. after grade-purified by ammonium sulfate) §2. 层析 (chromatography) - 逆流分溶原理 Kd = q (动相) p (静相) 分配系数： - 离子交换层析 (电荷状态) - 混合物中不同组分对树脂中带电 基团的亲合力将受到溶液pH (决定 各组分的电离状态)和游离盐离子 浓度的影响 - 对阳离子交换剂 亲合力低(电负性 更强)的组分流经 层析柱的速度要相对更快一些 - 与阳离子交换剂结合得最紧密(电 正性最强)的组分则可通过采用盐 浓度更高或不同pH的缓冲液将其 最后洗脱 P5-18a AAs elution order at pH 3: acidic (A0) neutral (A+) basic (A2+) 阳离子交换剂的基质为电负性，可交换阳离子 - 分子筛/排阻层析 (颗粒大小) - 亲合/吸附层析 (配体亲和力) 5-18b/c §3. 电泳 (electrophoresis) 带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动之现象 - 电泳介质现多采用各种凝胶(eg. 琼脂糖、丙烯酰胺等) - 介质pH一般维持在碱性区，使蛋白质大多带负电荷而 向阳极迁移 - 蛋白质的迁移与其质量和电荷数密切相关 - SDS(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳) SDS是阴离子表面活性剂，能破坏氢键和疏水互作并与蛋白分子结合(~1.4g SDS/g protein)，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过蛋白质分子原有的负电荷，从而掩盖了不同蛋白质之间原有的电荷差别，使蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量的大小 分子量在15,000~200,000之间时，蛋白质的电泳迁移率与其分子量的对数值正相关 - 等电聚焦电泳(IFE) 利用特定两性电解质构建的缓冲液在电场作用下于凝胶内沿电场方向建立的pH梯度，使样品中具有不同pI的各种蛋白质最终均迁移至凝胶中相应的pH处而达到分离之目的 可以将相对分子质量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而相对分子质量不同的蛋白质分开 - 双向电泳 (two-dimensional electrophoresis) §4. 氨基酸序列分析 Frederick Sanger (1918-) the only one who got NP for Chem. in twice (1958 1980) - 各种蛋白质均具有其独特的AA序列， 可决定多肽链以何种方式折叠、盘绕 成独特的3D构象(功能基础) - AA序列异常有可能导致遗传病 (by 1 AA 1/3) eg. sickle cell anemia: ?链Glu6→Val6 - 不同物种的相似功能蛋白质常具有 类似的AA序列 eg. Ser-proteases的催化三联体 泛蛋白的全部76 AA对果蝇 和人均完全相同 P6-3 对酸水解远 比肽键稳定 ? 短肽可采用自动法测序 TFA 确定肽链的AA组分 鉴别肽链的N-端残基 (Sanger reagent) 鉴别肽链的N-端残基 以Edman降解法测定 短肽链的AA序列 PTC基 PTH-Aa (~270nm absop.) DNP-Aa (cf. Fig. 2-32) (cf. p42) 苯异硫氰PITC PTC基的引进只降低 1st个肽键的稳定性 TFA (三氟乙酸) cleaves N-terminal AA but leaves rest of p