无菌检查法解读.pptVIP

无菌检查法 沈立军 2013.09 操作背景 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。 无菌检查应在环境洁净度 10 000 级下的局部洁净度 100 级的单向流空气区域内或隔离系统中进行 全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出 培养基的制备及培养条件 培养基可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基进行配置。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在 2 ℃～ 25 ℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。 培养基的适用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。 一、无菌性检查: 每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），培养 14 天，应无菌生长。 二、灵敏度检查 菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第 0 代），试验用菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕 白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕 黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕 菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上； 接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培养18 小时～24 小时； 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23～28℃培养24～48 小时。 上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于100 cfu （菌落形成单位）的菌悬液。 培养基接种 取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基9 支，分别接种小于100 cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2 支，另1支不接种作为空白对照，培养3 天； 取每管装量为9ml 的改良马丁培养基5 支,分别接种小于100 cfu 的白色念珠菌、黑曲霉2 支，另1 支不接种作为空白对照，培养5 天。逐日观察结果。 结果判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。 方法验证试验 当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若该产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。 薄膜过滤法 直接接种法 直接接种法 取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8 管，分别接入小于100 cfu 的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2 管，取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4 管，分别接入小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2 管。其中1 管接入每支培养基规定量的供试品量，另1 管作为对照，按置规定的温度培养3～5 天。 结果判断 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。 如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证试验。 供试品的无菌检查 阳性对照: 试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48～72 小时应生长良好。 阴性对照： 供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。 直接接种法 直接接种法即取规定量供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良