第03章 高效液相色谱法.ppt

* 第三章 高效液相色谱法 第一节 高效液相色谱法 第二节 主要分离类型与原理 第三节 液相色谱的固定相与流动相 第四节 影响分离的因素与操作条件的选择 第五节 制备型液相色谱 第六节 高效毛细管电泳 * 第六节 高效毛细管电泳一、高效毛细管电泳仪器 * * * 二、高效毛细管电泳基本原理 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。 经典电泳分离法的不足：所用 分离柱的柱径大，柱较短，分 离效率不高（远低于HPLC）， 温度影响大。 高效毛细管电泳在技术上采取 了两项重要改进。 * 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进： 一是采用了0.05mm内径的毛细管； 二是采用了高达数千伏的电压。 ★ 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。 ★ 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加， ★ 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。 * 电泳现象与电渗流现象 电泳现象：带电离子在电场作用下的迁移，速度v电泳 电渗流现象： 玻璃表面存在硅羟基, pH3时, 形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度v电渗流 * 分离过程： 电场作用下,柱中出现：电泳现象和电渗流现象 带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和 正离子：两种效应的运动方向一致,在负极最先流出 中性粒子无电泳现象,受电渗流影响,在阳离子后流出 阴离子：两种效应的运动方向相反，v电渗流 v电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。 * 分离类型 1.毛细管区带电泳（CZE） 最普遍、最基本的一种分离模式。 2. 毛细管凝胶电泳（CGE） 将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 可分离测定蛋白质、DNA等。 * 3. 毛细管胶束电动色谱（MECC） 在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳流和电渗流的方向相反，且v电渗流 v电泳 ，则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。 可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。 * * 三、仪器装置 电压：0～30KV。 分离柱不涂敷任何固定液， 紫外或激光诱导荧光检测器 （可检测到：10-19～10-21 mol/L） * 四、影响柱效的因素及改进方法 热效应：焦耳热是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，选择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于200微安，一般几十微安。 电渗流控制：电渗流的大小和方向，依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。 使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂，则可以改变电渗流的方向。 * 五、主要特点和应用 高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。 高灵敏度：可检测出低至10-21 mol/L浓度的物质。 高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19种阳离子;4分钟可分离10种蛋白质. 试样用量少：仅需几nL（10-9 L）的试样 仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液。 不足之处： 进样不够方便。 应用范围相对较窄。 * 第七节 纸层析和薄层层析法 一、纸层析和薄层层析分离过程 纸层析和薄层层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方法不同的是在分离过程中一般不使用动力源。 纸层析和薄层层析流动相的移动是依靠毛细作用。 将试样点在色谱滤纸或层析板的一端，并将该端浸在作为流动相的溶剂（常称之为展开剂）中，随着溶剂向上的移动，经过试样点时，带动试样向上运动。 * 比移值 * * 二、操作技术 层析纸和层析板: 特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝，200～250目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.15～0.5mm）。干燥后即可使用。 * 1.展开剂 展开剂：由一种或多种溶剂按一定比例组成。 如用纸层析分离氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸：水=4：1：1 * 2.点样 点样: 用微量注射器或玻璃毛细管吸取